Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Tách chiết, định tính, định lượng DNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific). Một khuẩn lạc được nuôi lắc trong 10
đêm. Tế bào được thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Tế bào được hịa trở lại bằng cách thêm 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung RNase A. 250 µl đệm P2 (Lysis solution) được bổ sung vào dung dịch tế bào, hỗn hợp trong ống được đảo nhẹ 5 lần rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó được trung hịa bởi 350 µl đệm P3 (Neutralization solution). Ống được ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, ở 4oC. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) được bổ sung vào cột rồi ly tâm 10000 vịng/phút trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch qua cột. Bước này được lặp lại một lần nữa. 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) được bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ cột ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Plasmid được thu bằng cách ly tâm cột với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1 phút. Mẫu DNA plasmid tinh sạch được bảo quản ở –20°C.
2.2.2.2. Tách chiết DNA từ mô thực vật
DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa non theo quy trình của Doyle và Doyle (1987) [25]. Mẫu thực vật tươi được thu và bảo quản trong N2 lỏng cho tới khi tách chiết. 500 mg mẫu mô thực vật được nghiền thành bột mịn trong N2 lỏng và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml. 0,5 ml đệm CTAB được bổ sung vào mỗi ống, ống được lắc đều trong 15 giây. Hỗn hợp được ủ trong bể ổn nhiệt ở 65oC trong 50 phút. Ống được ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và phần dịch nổi được chuyển sang ống mới. Một thể tích dung dịch chloroform : isoamylalcohol (tỉ lệ thể tích 24 : 1) được bổ sung vào ống, lắc đều và đem đi ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Phần dịch nổi được chuyển sang ống mới. isopropanol và potassium acetate 0,6 M được bổ sung thêm vào ống theo tỉ lệ thể tích 1 : 1. Ống hỗn hợp này được đảo đều trong 5 – 7 phút rồi ủ ở –20oC trong 1 giờ. Ống được ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút để thu tủa. Kết tủa được rửa trong 500 µl ethanol 70%, sau đó ly tâm ống với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Kết tủa DNA được làm khơ ở nhiệt độ phịng. DNA tinh sạch được hòa tan bằng nước khử trùng khử ion trong 30 phút ở 60oC và bảo quản ở –20oC cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.3. Nhân bản DNA bằng PCR
Phản ứng trùng hợp chuỗi (polymerase chain reaction – PCR) là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt
[47]. Phản ứng PCR gồm các thành phần chính: dNTPs, mồi (primer), DNA polymerase, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và nước cất khử trùng khử ion. Phản ứng được thực hiện bằng máy gia nhiệt tự động (PCR) theo ba giai đoạn cơ bản. Giai đoạn biến tính (denaturation): DNA mạch kép được tách thành dạng mạch đơn ở nhiệt độ cao (94 – 95oC) trong vòng 30 – 60 giây. Giai đoạn lai – gắn mồi (hybridization): nhiệt độ được hạ thấp xuống 40 – 70oC, các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp bổ sung vào hai đầu đoạn DNA đích; giai đoạn này kéo dài 30 – 60 giây. Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase lắp ráp dNTPs tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch DNA khuôn bắt đầu từ đoạn mồi. Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào kích thước đoạn DNA đích, thường từ 30 giây đến nhiều phút. Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72oC trong vòng 10 phút và giữ sản phẩm ở 4oC cho đến khi phân tích.
2.2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose
DNA trong mẫu thí nghiệm được phát hiện và định lượng tương đối bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide (EtBr) theo phương pháp của Sambrook và Russel (2001) [60]. 1,0 g agarose được đun nóng trong 100 ml đệm TAE, sau đó làm nguội về 65oC và đổ vào khuôn đúc gel. Hỗn hợp mẫu gồm 5 l mẫu DNA được trộn với 1 l đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu bromophenol xanh và xylene cyanol được tra vào các giếng trên bản gel. Mẫu được điện di với hiệu điện thế 10 V/cm gel. Sau 30 phút, gel được lấy ra và nhuộm trong dung dịch EtBr nồng độ 50 µg/µl và được rửa bằng nước. Khi soi gel dưới ánh sáng tử ngoại, các băng DNA gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel đen.
2.2.2.5. Tinh sạch DNA từ gel agarose
Sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kit GenJET™ Gel Extraction (Thermo Fisher Scientific) theo quy trình hướng dẫn. Băng DNA quan
tâm được cắt chính xác từ gel agarose và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (Binding buffer) được bổ sung vào ống (1 µl đệm ~ 1 mg gel); ống được ủ ở 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm với tốc độ 10000 vịng/phút trong 1 phút. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) được bổ sung vào cột và ly tâm trong 1 phút ở vận tốc
10000 vòng/phút. Bước rửa cột được lặp lại một lần nữa. 100 µl đệm đẩy (Elution buffer) được bổ sung vào chính giữa lớp màng silica của cột. DNA được thu bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở tốc độ 10000 vòng/phút. Mẫu DNA tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose (mục 2.2.2.4) và được bảo quản ở –20°C.