Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. HỆ THỐNG CHỈNH SỬA GEN CRISPR/Cas9
1.4.2. Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
1.4.2.1. Giới thiệu chung về hệ thống CRISPR/Cas
Hệ thống CRISPR/Cas được phát hiện từ cuối những năm 1980, trong cơ chế miễn dịch của vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Những nghiên cứu sau đó đã tìm thấy CRISPR/Cas ở hầu hết các loài tảo (90%) và vi khuẩn (48%) [59]. Sau khi giải mã được vai trò của hệ thống CRISPR/Cas đối với vi khuẩn và vi khuẩn cổ, hệ thống này đã được cải biến để sử dụng như một công cụ chỉnh sửa bộ gen.
Các hệ thống CRISPR được xác định cho đến nay được được chia thành ba loại (I, II và III) dựa vào sự có mặt của các protein Cas3, Cas9 (hoặc Csn1) và Cas10 tương ứng. Hệ thống CRISPR/Cas loại I được tìm thấy ở cả tảo và vi khuẩn; trong khi đó hệ thống CRISPR/Cas loại II (CRISPR/Cas9) chỉ có vi khuẩn; cịn hệ thống loại III chủ yếu có ở tảo và một vài lồi vi khuẩn. Cả 3 hệ thống CRISPR/Cas đều chứa một locus CRISPR với protein Cas1 và Cas2, nhưng khác nhau ở domain liên kết crRNA (CRISPR RNA) và domain khởi động q trình cắt. Locus CRISPR mang thơng tin về các nguồn bệnh (vật liệu di truyền ngoại lai) trong quá khứ; các gen Cas mã hóa các protein làm trung gian cho khả năng miễn dịch dựa trên CRISPR. Các locus CRISPR bao gồm các chuỗi đối xứng gương (palindromic) dài khoảng 30 Nu tạo thành các chuỗi các trình tự, gọi là spacer, có nguồn gốc từ vật liệu di truyền
ngoại lai. Các locus CRISPR với các spacer và gen Cas là những thành phần cần thiết để hệ thống CRISPR/Cas có thể hoạt động làm trung gian miễn dịch chống lại các
mầm bệnh. Mặc dù gen Cas thường được liên kết với locus CRISPR, nhưng trong
một số trường hợp chúng được tìm thấy ở nơi khác trong hệ gen. Đích tác động của hệ thống CRISPR/Cas là DNA hoặc RNA của mầm bệnh xâm nhập vào tế bào. Nhiều protein Cas có hoạt tính RNase và/hoặc DNase, có vai trị quan trọng trong hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas [10, 43].
1.4.2.2. Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
Hệ thống CRISPR/Cas loại II là hệ thống hoạt động hiệu quả nhất và đơn giản nhất, chỉ chứa một nhóm gồm 4 protein (Cas1, Cas2, Cas9 và Cas4/Csn2). Cas9 (trước đây được gọi là Csn1) là một protein kích thước lớn sở hữu hai miền (domains) RuvC nuclease domain và HNH nuclease domain, có thể xử lý phân tử tiền crRNA tạo thành crRNA hoàn chỉnh và xúc tác phản ứng cắt sợi đơi DNA mục tiêu tại vị trí xác định. Ngồi ra trong hệ thống này cịn có sự có mặt của phân tử tracrRNA (trans– encoded CRISPR RNA) điều hướng cho phản ứng cắt DNA. Tất cả các hệ thống CRISPR/Cas đều hoạt động qua ba bước cơ bản: thu nhận (adaptation), biểu hiện (expression) và can thiệp (interference).
Quá trình thu nhận gồm 2 bước: (1) nhận biết DNA ngoại lai và (2) kết hợp trình tự DNA ngoại lai (spacer) vào locus CRISPR. Thông thường, trình tự phía trước spacer (protospacer) chứa đoạn trình tự PAM – protospacer adjacent motif, là đoạn
DNA ngắn bảo thủ dài 2 – 5 Nu, có vai trị là motif nhận biết trong quá trình thu nhận mảnh DNA ngoại lai. Spacer sau khi được nhân bản thành 2 bản sao, 1 trong 2 bản sao sẽ được chèn vào phía đầu của chuỗi CRISPR. Đột biến xuất hiện ở vị trí trình tự
PAM có thể cản trở đáp ứng miễn dịch chống lại mầm bệnh. Bước thứ hai trong chuỗi
hoạt động của hệ thống CRISPR là biểu hiện: một phân tử tiền crRNA được phiên mã từ locus CRISPR biến đổi thành crRNA hoàn chỉnh nhờ sự trợ giúp của các protein Cas (Cas1, Cas2, Cas9 và Cas 4/Csn2) và phân tử tracrRNA. Gần đây, tracrRNA đã được phát hiện có tham gia vào quá trình xử lý tiền crRNA ở Streptococcus pyogenes. Phân tử tracrRNA bắt cặp với vùng lặp trên crRNA theo nguyên tắc bổ sung và tham gia vào q trình biến đổi tiền crRNA thành crRNA hồn chỉnh. Phân tử crRNA hoàn chỉnh tham gia vào phức hệ CRISPR và giúp nhận biết vị trí đích đặc hiệu trên DNA ngoại lai. Ở bước can thiệp, phân tử crRNA sẽ dẫn đường cho phức hệ protein Cas
tới vị trí đích đặc hiệu trên chuỗi DNA ngoại lai (Hình 1.7). Phản ứng cắt DNA sợi được xúc tác giúp tế bào chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh [10, 43].
Hình 1.7: Cơ chế cắt DNA của phức hệ protein CRISPR/Cas9 [43]
Ghi chú: DNA đích bị cắt tại vị trí mũi tên; Cas9 nuclease: enzyme Cas9 liên kết
CRISPR; PAM: protospacer adjacent motif; crRNA: RNA CRISPR; tracrRNA: trans- encoded CRISPR RNA; sgRNA: single guide RNA; RuvC và HNH: hai miền (domains) cắt của enzyme Cas9.
Dựa trên hệ thống CRISPR loại II được mô tả trước đây, năm 2012, Douna và Charpentier đã phát triển một hệ thống hai thành phần đơn giản hóa bằng cách kết hợp tracrRNA và crRNA thành một RNA dẫn đường (single guide RNA – sgRNA) tổng hợp để phối hợp với enzyme Cas9. Nhìn chung, cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas9 về cơ bản là quá trình sgRNA điều tiết endonuclease Cas9 cắt đặc hiệu DNA sợi đơi, từ đó hoạt hóa hệ thống sửa chữa đứt gãy mạch đôi (double–strand break – DSB) của tế bào [16]. Kể từ đó, các nhà nghiên cứu đã có thể dễ dàng lập trình một bộ cơng cụ chỉnh sửa hệ gen mục tiêu bằng CRISPR/Cas9. Bắt đầu với việc lựa chọn trình tự đích có chuỗi PAM ở đầu 3’; sau khi xác nhận vị trí đích, các
oligonucleotide đích (crRNA) được thiết kế để tiếp tục dung hợp với chuỗi tracrRNA để tạo thành sgRNA. SgRNA được chèn vào một vector cùng với cấu trúc biểu hiện Cas9 (vector nhị phân) hoặc riêng lẻ dưới sự điều khiển của các promoter phù hợp cho mỗi cấu trúc. Các cấu trúc sau đó được đưa vào tế bào bằng các phương pháp
phù hợp. Các hệ thống vector khác nhau được lựa chọn tùy thuộc vào đối tượng, mục đích và yêu cầu của nghiên cứu. Hoạt tính phân giải đặc hiệu theo vị trí của phức hệ sgRNA/Cas9 được quyết định bởi đoạn trình tự dài khoảng 20 Nu (crRNA) trên phân tử sgRNA. Việc thiết kế đoạn trình tự crRNA dài 20 Nu đơn giản hơn rất nhiều so với thiết kế phức hệ ZFN và TALEN. Do đó, người dùng có thể dễ dàng thay đổi mục tiêu của protein Cas bằng cách thay đổi trình tự đích crRNA trong sgRNA [10, 43].
1.4.2.3. Ưu và nhược điểm của hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
CRISPR không phải là công cụ chỉnh sửa hệ gen đầu tiên, nhưng nó đơn giản nhất, nhanh nhất và rẻ nhất. Đó là lý do tại sao kĩ thuật này đã vượt xa các kỹ thuật chỉnh sửa gen trước đó như ZFN và TALEN. Cả ZFN và TALEN đều là các công cụ chỉnh sửa dựa trên protein và có thể lập trình được. Nhưng đối với mỗi mục tiêu mới, một protein (một cặp nuclease) mới phải được thiết kế. Việc này tốn nhiều thời gian, công sức và trong trường hợp ZFN là một quá trình tốn kém. Hiệu quả hoạt động (on–target) hay tỷ lệ phần trăm đột biến mong muốn đạt được, là một trong những thông số quan trọng nhất để đánh giá một công cụ chỉnh sửa hệ gen. Hiệu quả hoạt động của Cas9 cao hơn nhiều so với TALEN hoặc ZFN. Ví dụ, trong các tế bào của con người, các ZFN và TALEN được thiết kế tùy chỉnh chỉ có thể đạt được hiệu suất từ 1 – 50%. Trong khi đó, hệ thống Cas9 đã được báo cáo là có hiệu suất lên tới > 70% ở cá ngựa vằn và thực vật, và dao động từ 2 – 5% trong các tế bào gốc đa năng cảm ứng. Ngoài ra, Zhou và các đồng nghiệp đã cải tiến hiệu quả hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 lên tới 78% trong phôi chuột một tế bào và sử dụng sgRNA kép để gây đột biến đồng thời nhiều vị trí mục tiêu khác nhau [10, 43].
Cơng nghệ CRISPR/Cas9 đã thay thế vị trí của cơng nghệ RNAi (RNA interference – can thiệp RNA) trong các nghiên cứu kiểm sốt biểu hiện gen thơng qua bất hoạt gen hiệu quả và chính xác. Cơng nghệ này đã khắc phục những hạn chế của cơng nghệ RNAi, chẳng hạn như tính đặc hiệu và hiệu suất hoạt động thấp. Hơn nữa, việc dễ dàng tạo ra các sgRNA khiến cho hệ thống CRISPR/Cas9 có thể dễ dàng thay đổi mục tiêu. Nhờ đó, CRISPR/Cas9 trở thành một trong những hệ thống chỉnh sửa gen có nhiều ứng dụng nhất [43].
Những hạn chế chính của cơng nghệ CRISPR/Cas9 bao gồm tỷ lệ chỉnh sửa không hiệu quả của cả hai cơ chế HR và NHEJ. Các thay đổi cũng rất ít xảy ra đồng thời trên mỗi tế bào. Sự xuất hiện của nhiều trình tự tương đồng với trình tự mục tiêu trong hệ gen tế bào chủ cũng là nguyên nhân làm cản trở hiệu quả sử dụng công nghệ này. Một trong những nhược điểm chính của CRISPR/Cas9 là độ đặc hiệu của sgRNA. SgRNA vẫn dẫn đường tới một trình tự tương đồng với trình tự mục tiêu cho dù một vài nucleotide của crRNA khơng khớp với trình tự này. Tuy nhiên, nhìn chung CRISPR/Cas9 vẫn được xem là công cụ chỉnh sửa hệ gen hiệu quả nhất và dễ sử dụng nhất ở thời điểm hiện tại [10, 43].