VXO_72) bằng phương pháp cắt lá. (ĐC): đối chứng âm (cây lúa TBR225 được lây nhiễm bằng dung dịch không chứa vi khuẩn Xoo). Đồ thị biểu hiện chiều dài vết bệnh trên lá lúa sau 14 ngày lây nhiễm. Số liệu trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Nhiều phương pháp lây nhiễm nhân tạo bệnh bạc lá lúa đã được nghiên cứu và áp dụng, trong số đó phương pháp cắt kéo được chứng minh là có hiệu quả hơn cả [9, 35]. Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong các nghiên cứu đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh bạc lúa trên thế giới và tại Việt Nam [2, 5, 32, 52]. Ở miền Bắc, TBR225 là giống lúa chủ lực nhưng có nhược điểm là mẫn cảm với bệnh bạc lá, tuy nhiên hầu như chưa có nghiên cứu nào đánh giá tính kháng/nhiễm của TBR225 với các chủng Xoo của Việt Nam. Kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy TBR225 có biểu hiện bệnh bạc lá rõ rệt sau khi được lây nhiễm 17 chủng
Xoo thu thập từ một số địa phương trồng lúa phía Bắc, chứng tỏ tính mẫn cảm của
TBR225 với bệnh bạc lá.
3.1.2. Nghiên cứu vai trị của OsSWEET14 đối với q trình lây nhiễm của vi khuẩn Xoo
Họ gen OsSWEET gồm các gen mã hóa cho các protein vận chuyển đường ở thực vật, được cho là có liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh
bạc lá lúa Xoo thơng qua q trình giải phóng phân tử đường vào gian bào
(apoplast) và cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn. Sau khi xâm nhiễm thành công, vi khuẩn tiết ra các protein đặc biệt có khả năng hoạt hóa sự biểu hiện các gen
SWEET khác nhau, từ đó kiểm sốt dịng chảy chất dinh dưỡng trong cây chủ [21,
20]. Một số gen như OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14 đã được xác định là đích tác động của một số TAL effector và hoạt động như “gen mẫn cảm” (susceptibility gene) đối với Xoo [13, 20, 29, 66]. Đặc biệt, nghiên cứu hệ gen của một số giống lúa mang alen kháng bạc lá xa41(t) cho thấy các giống lúa này mang đột biến mất 18 bp trên promoter OsSWEET14 và có thể kháng hơn 50% các chủng vi khuẩn Xoo của châu Á và châu Phi (đã biết) [56]. Gần đây, Blanvillain–Baufumé và nhóm nghiên cứu (2017) đã sử dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen TALEN để tạo ra dòng lúa Kitaake đột biến gen OsSWEET14 (Kitaake–MU) thể hiện tính
kháng đối với chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh trước đó [13]. Trong nghiên cứu này, hai dòng lúa Kitaake–WT và Kitaake–MU đã được sử dụng để dự đốn vai trị của
OsSWEET14 đối với cơ chế gây bệnh của các chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại
miền Bắc Việt Nam.
Để thực hiện thí nghiệm này, 6 chủng Xoo đại diện cho 6 địa phương trồng lúa đã được lựa chọn ngẫu nhiên cho thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo, bao gồm: VXO_52 (Hà Nội), VXO_54 (Nam Định), VXO_59 (Bắc Giang), VXO_60 (Nghệ An), VXO_61 (Hải Phịng) và VXO_62 (Thái Bình). Kết quả lây nhiễm 6 chủng vi khuẩn Xoo đại diện trên 2 dịng lúa Kitaake–WT và Kitaake–MU (Hình 3.3) cho thấy cây lúa Kitaake–WT mẫn cảm với tất cả các chủng Xoo đại diện, chiều dài vết bệnh đo được từ 16 cm (VXO_60) đến 26 cm (VXO_62). Trong khi đó, Kitaake–MU thể hiện tính kháng đối với 5/6 chủng, thể hiện ở chiều dài các vết bệnh đều thấp hơn 8 cm. Duy nhất chủng VXO_60 gây ra độc tính mạnh trên cả 2 dịng lúa Kitaake–WT và Kitaake–MU, thể hiện ở chiều dài vết bệnh đo được lần lượt là 17 cm và 20 cm. Kết quả này cho phép dự đốn gen
OsSWEET14 có thể liên quan đến cơ chế xâm nhiễm gây bệnh bạc lá lúa của hầu
hết (5/6 chủng) vi khuẩn Xoo đại diện, bao gồm VXO_52, VXO_54, VXO_59,
Hình 3.3: Độc tính của các chủng vi khuẩn Xoo đại diện trên lúa Kitaake Ghi chú: Cây lúa Kitaake bình thường (WT) và mang đột biến gen OsSWEET14
(MU) được lây nhiễm với 6 chủng vi khuẩn Xoo đại diện (VXO_52, 54, 59, 60, 61 và
62) bằng phương pháp cắt lá. (A) Lá cây lúa sau 14 ngày lây nhiễm vi khuẩn; mũi tên thể hiện điểm kết thúc của vết bệnh. (B) Đồ thị so sánh chiều dài vết bệnh trên
các mẫu lá lúa sau 14 ngày lây nhiễm. Số liệu trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Ở Việt Nam, trong một số chương trình chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá, các dòng lúa chỉ thị (tester) mang QTL (quantitative trait locus) kháng bệnh bạc lá thường được sử dụng để xác định gen kháng tương ứng với các chủng Xoo quan tâm. Từ đó, thơng qua phương pháp lai tạo kết hợp với chọn lọc bằng chỉ thị phân tử, các QTL này được đưa vào giống lúa mục tiêu để tạo ra giống kháng bệnh. Mặt khác, nguồn gen kháng cũng được xác định/ khảo sát trên một số giống lúa tự nhiên có tính kháng bệnh bạc lá bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử có sẵn [4, 6]. Tuy nhiên, cho đến nay hầu như chưa có một nghiên cứu nào về cơ chế
phân tử của quá trình xâm nhiễm của các chủng vi khuẩn Xoo Việt Nam trên các giống lúa phổ biến, đặc biệt là mối liên quan với các gen vận chuyển đường được thực hiện. Nghiên cứu này lần đầu tiên đã chứng tỏ cơ chế gây bệnh bạc lá lúa của một số chủng vi khuẩn Xoo đại diện thu thập tại Việt Nam có thể liên quan tới hoạt động của gen OsSWEET14. Trong một nghiên cứu khác, nhóm nghiên cứu của
Tiến sĩ Cao Lệ Quyên (Viện Di truyền Nông nghiệp) cũng đã chứng minh gen
OsSWEET14 được hoạt hóa biểu hiện sau khi lây nhiễm nhân tạo bởi 3/5 chủng vi
khuẩn Xoo đại diện này (số liệu chưa được công bố). Các kết quả bước đầu này đã cho thấy tiềm năng to lớn của hướng nghiên cứu cải tạo khả năng kháng bệnh bạc lá phổ rộng cho giống lúa TBR225 thông qua việc chỉnh sửa gen OsSWEET14
bằng công nghệ CRISPR/Cas9.
3.2. NHÂN DỊNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ PROMOTER SW14–TBR
3.2.1. Nhân bản promoter SW14–TBR
Trong nhiều nghiên cứu về promoter đã được công bố, đoạn DNA quan tâm thường được phân lập và dịng hóa vào vector nhân dịng trước khi đưa vào vector biểu hiện nhằm phục vụ việc nghiên cứu chức năng [22, 48]. Streubel. J và nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập đoạn DNA dài 341 bp nằm trên promoter OsSWEET14 để nghiên cứu chức năng và vai trò của gen OsSWEET14 đối với cơ chế xâm nhiễm của Xoo trên giống lúa IRBB13 [66]. Trong nghiên cứu này, trình tự promoter đầy đủ và một phần mã hoá trên gen OsSWEET14 của giống lúa TBR225 (gọi tắt là SW14–TBR) được phân lập bằng PCR từ DNA tổng số của mẫu lá lúa non để phân
tích trình tự nucleotide nhằm dự đốn vai trị của gen OsSWEET14 đối với quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn Xoo trên lúa TBR225, đồng thời phục vụ nghiên cứu tạo giống lúa TBR225 kháng bệnh bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa promoter/gen sau này. Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi SW14–Fw/SW14–Rv được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide của OsSWEET14 đã được công bố trên Genbank.
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy sản phẩm PCR chỉ xuất hiện một băng DNA duy nhất có kích thước xấp xỉ 1,4 kb tương ứng với kích thước lý thuyết của đoạn promoter SW14–TBR (1392 bp) (Hình 3.4, giếng 2). Như vậy, đoạn promoter
Hình 3.4: PCR nhân bản promoter SW14–TBR
Ghi chú: Sản phẩm PCR với cặp mồi SW14–Fw/SW14–Rv được điện di trên gel
agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2: khn là DNA tổng số của lúa TBR225.
3.2.2. Nhân dòng promoter SW14–TBR
Sản phẩm PCR nhân bản đoạn promoter SW14–TBR từ DNA tổng số được tinh sạch, sau đó được ghép nối vào vector nhân dòng pGEM–T (Phụ lục 2) và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Thể biến nạp là các khuẩn lạc màu trắng xuất hiện trên mơi trường chọn lọc có bổ sung chất kháng sinh ampicillin được sàng lọc để kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter SW14–TBR bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi T7–Pro/SP6–Pro.
Hình 3.5: PCR trực tiếp khuẩn lạc được biến nạp pGEM/SW14–TBR
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi T7–Pro/SP6–Pro được
điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: đối chứng dương (khuôn là vector pGEM/NLI–IF; giếng 2: đối chứng âm (khuẩn lạc không được biến nạp DNA); giếng 3 – 8: khuẩn lạc được biến nạp pGEM/SW14–TBR.
Kết quả điện di sản phẩm trên gel agarose 1% cho thấy sự xuất hiện của 1 băng DNA duy nhất có kích thước xấp xỉ 1,6 kb (Hình 3.5, giếng 3 – 8) tương ứng với kích thước tính tốn lý thuyết (trong đó bao gồm đoạn promoter SW14–TBR và đoạn trình tự 186 bp là khoảng cách giữa hai mồi T7–Pro/SP6–Pro trên vector pGEM–T, tương tự như phản ứng đối chứng dương sử dụng vector pGEM/NLI–IF làm khn (Hình 3.5, giếng 1). Ngược lại, sản phẩm của phản ứng đối chứng âm (với khuôn là khuẩn lạc không được biến nạp DNA) không thu được băng DNA nào (Hình 3.5, giếng 2). Kết quả này cho phép chúng tôi bước đầu kết luận đã thu nhận được các khuẩn lạc dương tính có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn promoter SW14–TBR.
Một khuẩn lạc trắng có kết quả PCR dương tính sau đó được chọn ngẫu nhiên để nuôi cấy, tách chiết DNA plasmid và kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt bằng enzyme giới hạn (Hình 3.6). Kết quả điện di trên gel agarose 1% trên hình 3.6A cho thấy sản phẩm PCR từ khuôn plasmid với cặp mồi SW14–Fw/SW14–Rv (đặc hiệu cho đoạn promoter SW14–TBR) cho một băng DNA có kích thước khoảng 1,4 kb
(Hình 3.6A, giếng 2), trong khi sản phẩm PCR với cặp mồi T7/SP6 đặc hiệu cho vector pGEM–T (có khoảng cách 186 bp trên pGEM–T) cho một băng DNA có kích thước xấp xỉ 1,6 kb (Hình 3.6A, giếng 4), phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn DNA cần nhân bản.
Tương tự, kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn plasmid pGEM/SW14–TBR bằng EcoRI (đoạn DNA được chèn vào giữa hai vị trí nhận biết của EcoRI trên vector pGEM–T) (Hình 3.6 B, giếng 1) hay NdeI (có 1 vị trí nhận biết ở Nu thứ 6 – 11 trên promoter SW14–TBR và 1 vị trí khác trên vector pGEM–T) (Hình 3.6 B, giếng 2) đều cho hai băng DNA có kích thước lần lượt khoảng 3,0 kb tương ứng với bộ khung vector pGEM–T và xấp xỉ 1,4 kb tương ứng với đoạn promoter SW14–TBR đúng như tính tốn lý thuyết. Ngồi ra, sản phẩm cắt giới hạn đồng thời bằng NdeI và BglII (có 1 vị trí nhận biết ở Nu thứ 1331 – 1336 trên promoter SW14–TBR) cũng thu được các băng DNA đúng với tính tốn theo lý thuyết, trong đó đoạn SW14–TBR bị cắt thành 2 mảnh có kích thước khoảng 1,3 kb và 0,1 kb (Hình 3.6 B, giếng 3). Các kết quả thu được cho phép khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dịng thành cơng đoạn promoter
Hình 3.6: PCR và cắt giới hạn vector pGEM/SW14–TBR
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn pGEM/SW14–TBR được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi SW14–
Fw/SW14–Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7–Pro/SP6–Pro; giếng 1 và 3: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2 và 4: khn là pGEM/SW14–TBR.
(B) Cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới hạn; giếng 1: sản phẩm cắt giới
hạn bằng EcoRI; giếng 2: sản phẩm cắt bằng NdeI; giếng 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng NdeI/BglII; giếng 4: vector pGEM/SW14–TBR nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
3.2.3. Giải trình tự promoter SW14–TBR
Để khẳng định chính xác đoạn DNA phân lập được là promoter SW14–TBR,
vector tái tổ hợp pGEM/SW14–TBR được giải trình tự nucleotide bằng hệ thống máy giải trình tự ABI3100 và phân tích bằng phần mềm BioEdit. Kết quả so sánh trình tự nucleotide cho thấy đoạn promoter SW14–TBR phân lập được có chiều dài 1392 bp (Phụ lục 3), giống 99% so với trình tự promoter OsSWEET14 của giống lúa
Niponbare (Japonica, mã số AP014967.1) và giống ~100% (1 vị trí sai khác) so với trình tự promoter OsSWEET14 của giống lúa Shuhui498 (Indica, mã số CP018167.1) đã được cơng bố trên GenBank (Hình 3.7).
Kết quả phân tích trình tự chi tiết hơn bằng phần mềm Benchling [89] cho thấy trình tự đoạn DNA phân lập được nằm từ vị trí (–1341) đến (+51) của OsSWEET14, bao gồm vùng promoter dài 1341 bp và một đoạn dài 51 bp mang tồn bộ trình tự mã hóa của Exon I. Đoạn promoter SW14–TBR phân lập được cũng chứa trình tự TA
Box đặc trưng cho vùng promoter ở vị trí (–259). Đặc biệt, trên promoter SW14–TBR có chứa 4 trình tự DNA (yếu tố điều hòa cis) liên kết đặc hiệu với protein TAL, được
gọi là EBE (effector–binding element), của một số chủng vi khuẩn Xoo đã được công bố [14], bao gồm TalC, Tal5, PthXo3 và AvrXa7 (Hình 3.8). EBE TalC và Tal5 đã được Yu xác định nằm trên promoter OsSWEET14 của lúa Niponbare [80], trong khi EBE PthXo3 và AvrXa7 được chứng minh là vị trí tương tác của protein TAL PthXo3 và AvrXa7 với gen OsSWEET14 của giống lúa Kitake, Niponbare và IR24 [77, 82]. Trong nghiên cứu này, promoter OsSWEET14 của lúa TBR225 đã được xác định có chứa cả 4 trình tự EBE nói trên. Tuy nhiên, vai trị chính xác của các EBE này đối với tính mẫn cảm của lúa TBR225 với các chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại miền Bắc Việt Nam sẽ cần được nghiên cứu thêm.
Hình 3.7: So sánh trình tự promoter SW14–TBR giữa các giống lúa
Ghi chú: Trình tự promoter OsSWEET14 của giống lúa TBR225, Niponbare (mã
số AP014967.1) và Shuhui498 (mã số CP018167.1) được so sánh với nhau. Vị trí Nu giống nhau được đóng khung.
Hình 3.8: Đặc điểm trình tự Nu trên promoter SW14–TBR
Ghi chú: Hộp TATA (TATA box) được đóng khung. Vị trí các EBE được đánh dấu
bằng mũi tên.
Các kết quả phân tích trình tự chứng tỏ promoter OsSWEET14 từ DNA của giống lúa TBR225 đã được phân lập thành cơng, đồng thời đã xác định được vị trí của 4 trình tự DNA trên promoter SW14–TBR là các EBE đã được công bố.
Kết quả này, kết hợp cùng với kết quả đánh giá độc tính của vi khuẩn Xoo trên giống lúa Kitaake (mục 3.1.2) đã làm rõ hơn cho dự đốn về vai trị quan trọng của OsSWEET14 đối với cơ chế gây bệnh bạc lá của một số chủng vi khuẩn Xoo thu thập ở miền Bắc Việt Nam. Khi xâm nhiễm vào tế bào lúa TBR225, các vi khuẩn Xoo này có thể đã tiết ra các protein TAL hoạt động như những nhân tố phiên mã, liên kết với các EBE trên vùng promoter của các gen vận chuyển đường (trong đó có OsSWEET14) và hoạt hóa gen để tăng cường biểu hiện các protein OsSWEET vận chuyển đường phục vụ cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Dựa trên dữ liệu đầy đủ về trình tự nucleotide của gen mục tiêu, việc sử dụng cơng nghệ gây đột biến chính xác tại các vị trí EBE có thể giúp ngăn chặn/giảm độc tính của vi khuẩn Xoo trên giống lúa TBR225. Ngoài ra, việc gây đột biến dịch khung (thêm/bớt nucleotide) trên vùng Exon I để bất hoạt hoàn toàn (knock–
out) gen OsSWEET14 cũng là một hướng nghiên cứu để tạo ra giống lúa TBR225 kháng bệnh bạc lá.
3.3. THIẾT KẾ CẤU TRÚC CHỈNH SỬA PROMOTER SW14–TBR
3.3.1. Thiết kế trình tự crRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR
Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 hoạt động dựa trên khả năng cắt chính xác DNA sợi đơi tại vị trí mong muốn của phức hệ protein/RNA CRISPR/Cas9, trong đó bao gồm hai thành phần chính: (1) protein Cas9 có hoạt tính endonuclease và (2) phân tử sgRNA (single guide RNA) có vai trị dẫn đường cho phức hệ đến đúng vị trí DNA cần cắt. Tính đặc hiệu của phức hệ CRISPR/Cas9 được quyết định bởi đoạn trình tự dài ~20 nucleotide (crRNA) trên phân tử sgRNA [16]. Để phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter gen SW14–TBR bằng hệ thống CRISPR/Cas9, trình tự crRNA được thiết kế nhằm gây đột biến tại các vị trí EBE trên promoter SW14–TBR hoặc trên vùng Exon I của gen này.
Bằng phần mềm CRISPR MultiTargeter [86], 119 trình tự (20 Nu) trên promoter
SW14–TBR đã được xác định nằm phía trước vị trí nhận biết bảo thủ PAM (protopacer
adjacent motif – NGG), bao gồm 57 trình tự thuộc sợi DNA (+) và 62 trình tự thuộc sợi (–) (Dữ liệu khơng được trình bày). Trong đó, 2 trình tự crRNA có điểm cắt tại vị trí của EBE TalC, 1 trình tự crRNA có điểm cắt tại vị trí của EBE AvrXa7 và PthXo3, 8 trình tự crRNA có điểm cắt có thể tác động đồng thời đến cả ba vị trí của EBE là
AvrXa7, PthXo3 và Tal5 (gọi tắt là vị trí Tal5), 6 trình tự crRNA có điểm cắt tác động
đến Exon I (Bảng 3.1). Các trình tự cịn lại có điểm cắt cách xa (> 20 Nu) so với vị trí các EBE và Exon I, có khả năng tác động đến vị trí đích kém hơn, vì thế đã khơng được lựa chọn để tiếp tục phân tích.