Tên Trình tự crRNA (5’ – 3’) % GC TBP CBP IBP DSL Điểm đặc hiệu Điểm khơng đặc hiệu Đích tác động crRNA–1 TGCTGACATGCATGCCCTTA 50 8 0 4 SL1 29,5 48,4 TalC crRNA–2 AGGGCATGCATGTCAGCAGC 60 7 4 3 SL1 51,4 47,6
crRNA–3 GAGGGGGTTTATATAGTGCT 45 9 7 0 SL1 51,5 39,8 AvrXa7, PthXo3 crRNA–4 TATATAAACCCCCTCCAACC 45 0 0 0 * 57,1 49,2 AvrXa7, PthXo3, Tal5 crRNA–5 GCTTAGCACCTGGTTGGAGG 60 8 6 2 SL1 50,6 48,1 crRNA–6 AGCTTAGCACCTGGTTGGAG 55 8 6 2 SL1 51,9 48,7 crRNA–7 GAGCTTAGCACCTGGTTGGA 55 8 6 2 SL1 50,3 49 crRNA–8 TGAGCTTAGCACCTGGTTGG 55 8 6 2 SL1 40,3 48,6 crRNA–9 TGATGAGCTTAGCACCTGGT 50 12 6 0 SL1 48,4 49,6 crRNA–10 GGCTTGATGAGCTTAGCACC 55 9 4 5 SL1 57,9 48,4 crRNA–11 CTTGAGTTTGCTTTGCTTGA 40 7 4 0 SL1 27,8 46,1 crRNA–12 CAAGATCTTGCTGCAATGGC 50 7 3 4 SL1 44 48,4 Exon I crRNA–13 GCATGTCTCTTCAGCATCCC 55 2 0 2 * 26,8 48,6 crRNA–14 CATGTCTCTTCAGCATCCCT 50 4 2 2 SL1 50,8 48,6 crRNA–15 CATCCCTGGGCCTTCGCCTT 65 9 5 0 SL1 32 49,3 crRNA–16 AGACCAAAGGCGAAGGCCCA 60 10 4 0 SL1 59,5 48,7 crRNA–17 GAGACCAAAGGCGAAGGCCC 65 10 4 0 SL1 N/A 48,7
Ghi chú: (% GC) tỉ lệ phần trăm GC, (TBP) tổng số cặp bazơ, (CBP) số cặp bazơ liên tục, (IBP)
số cặp bazơ của trình tự crRNA trong trúc bậc II của sgRNA; (DSL) vòng loop trong sgRNA bị phá vỡ cấu trúc; (RAR) Stem loop Repeat and Anti–repeat Region, (SL1, 2, 3) Stem loop 1, 2, 3; (*) không ảnh hưởng đến cấu trúc vòng loop trong sgRNA; (TalC, AvrXa7, PthXo3, Tal5) Các EBE trên promoter SW14–TBR; Điểm đặc hiệu – on target) Điểm dự đoán khả năng nhận biết đúng vị trí đích (từ 0 – 100); (Điểm khơng đặc hiệu – off target) Điểm dự đoán khả năng nhận biết sai vị trí đích (từ 0 – 100).
Bên cạnh những ưu điểm về tính đơn giản, thuận tiện và khả năng ứng dụng lớn, hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 có nhược điểm so với các hệ thống chỉnh sửa gen khác (TALEN, ZFN...) đó là tính đặc hiệu, do sgRNA chỉ nhận biết 20 nucleotide và Cas9 vẫn có thể hoạt động dù trình tự DNA đích có một vài nucleotide sai khác so với crRNA [10, 16]. Nhằm giảm thiểu khả năng nhận biết sai vị trí (off target) của
phức hệ Cas9/sgRNA, trình tự của các crRNA tiếp tục được phân tích bằng cơng cụ CRISPR trong phần mềm Benchling [89] để dự đốn tính đặc hiệu của các trình tự crRNA. Tính đặc hiệu được tính bằng tổng điểm đặc hiệu (on target) và điểm không đặc hiệu (off target) của crRNA. Kết quả phân tích (Bảng 3.1) cho thấy đối với từng vị trí EBE hay Exon quan tâm, các trình tự crRNA–2 (tác động đến TalC), crRNA– 4, crRNA–6, crRNA–10 (tác động đến Tal5) và crRNA–16 (tác động đến Exon I) có tính đặc hiệu cao nhất, tổng điểm đặc hiệu lần lượt đạt 99 điểm, 106,3 điểm, 100,6 điểm, 106,3 điểm và 108,2 điểm. Các trình tự crRNA này sẽ đảm bảo sự duy trì hoạt tính và tính đặc hiệu của phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter SW14–TBR hơn so với các trình tự crRNA cịn lại.
Hình 3.9: Cấu trúc bậc II của sgRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR. Ghi chú: Mơ hình cấu trúc bậc II của sgRNA–2 (A) và sgRNA–10 (B) được dự đoán Ghi chú: Mơ hình cấu trúc bậc II của sgRNA–2 (A) và sgRNA–10 (B) được dự đoán
bằng phần mềm Mfold 2.3 mang vùng crRNA và các cấu trúc vòng loop: Stem loop RAR (repeat and anti–repeat region), Stem loop 2 và Stem loop 3.
Để hạn chế/giảm thiểu ảnh hưởng tiêu cực khi xảy ra trường hợp nhận biết sai vị trí của phức hệ chỉnh sửa gen, một yếu tố khác cần được quan tâm đó là trình tự Nu gần giống với trình tự của crRNA khơng nên nằm trùng/gần với vùng mã hóa
của một gen bất kỳ. Do đó, trình tự và vị trí chính xác trong hệ gen lúa của các đoạn DNA gần giống với 5 crRNA đã được chọn ở trên tiếp tục được xác định bằng phần mềm CCTop [90].
Bảng 3.2: Trình tự DNA tương đồng với crRNA chỉnh sửa OsSWEET14 trong
hệ gen lúa
Tên Trình tự đoạn DNA giống/gần
giống crRNA trong hệ gen lúa
Vị trí nhận biết Khoảng cách đến Exon gần nhất Mã số gen đích
crRNA–2 ACGGCAAG[CAGGTCAGCAGC] – 986 Os01g0624700
crRNA–4 AATATTTA[CTCCCTCCAACC] – 5059 EPlOSAG00000012214
crRNA–6 TGGTTAGT[ACCTGGGTGGAG] E 0 Os11g0140300
crRNA–10 GCGACGAT[GAGCTTAGCACC] – 990 Os07g0298900
crRNA–16 GGGCCACT[GGCGAAGGCCCA] GGGCCACT[GGCGAAGGCCCA] AGGGCGAC[GGCGAAGGCCCA] AGGGCGAC[GGCGAAGGCCCA] AGGGCGAC[GGCGAAGGCCCA] AGGGCGAC[GGCGAAGGCCCA] AGGGCGAC[GGCGAAGGCCCA] AGGGCAGC[GGCGAAGGCCCA] AGAGCGGC[GGCGAAGGCCCA] AGAGCGGC[GGCGAAGGCCCA] AGAGCGGC[GGCGAAGGCCCA] – – – – – – – – – – – 1909 2937 615 1089 1199 3093 5059 1192 137 578 4586 Os10g0161100 EPlOSAG00000009160 EPlOSAG00000006462 Os02g0570500 EPlOSAG00000019798 EPlOSAG00000009599 EPlOSAG00000019536 EPlOSAG00000020018 EPlOSAG00000022991 EPlOSAG00000013860 EPlOSAG00000024561
Ghi chú: Chữ trong ngoặc [] thể hiện trình tự tương đồng với vùng lõi (12 nu) của crRNA; chữ
in đậm thể hiện vị trí sai khác so với vị trí Nu tương ứng trên sgRNA; (E): vùng exon; (–):không thuộc vùng exon hay intron.
Kết quả phân tích (Bảng 3.2) cho thấy ngồi trình tự nằm trên OsSWEET14,
crRNA–2 có duy nhất 1 trình tự DNA tương đồng trong hệ gen lúa, trong khi crRNA–16 có 11 trình tự DNA tương đồng trong hệ gen lúa. Tuy nhiên, tất cả các trình tự DNA tương đồng với hai crRNA này đều khơng nằm trong vùng mã hóa của gen và cách tương đối xa vị trí của Exon gần nhất. Tương tự, crRNA–4, crRNA– 6 và crRNA–10 cũng có 1 trình tự DNA tương đồng trong hệ gen lúa, nhưng chỉ có trình tự DNA tương đồng của crRNA–4 và crRNA–10 khơng nằm trên vùng gen mã hóa. Ngược lại, trình tự DNA tương đồng của crRNA–6 nằm trên vùng mã hóa (Exon) của một gen mã hóa protein chưa biết chức năng nên có khả năng gây ảnh
hưởng đến hoạt động chức năng của tế bào nếu xảy ra đột biến sai vị trí mong muốn. Bên cạnh đó, mặc dù trình tự DNA tương đồng với crRNA–4 và crRNA–10 đều có 4 Nu sai khác, chỉ có trình tự DNA tương đồng với crRNA–4 có 1 Nu sai khác nằm trong vùng lõi (seed region) của crRNA nên ít có khả năng xảy ra đột biến sai hơn so với crRNA–1.
Như vậy, tổng hợp các kết quả phân tích dự đốn cấu trúc và tính đặc hiệu có thể xác định các crRNA có thể sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến chỉnh sửa promoter SW14–TBR theo cơ chế ghép nối điểm cuối không tương đồng NHEJ [10, 49, 63] bằng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 [16, 43], bao gồm: crRNA–2 gây đột biến EBE TalC (gọi tắt là TalC–gRNA), crRNA–10 gây đột biến đồng thời 3 EBE là AvrXa7, PthXo3 và Tal5 (gọi tắt chung là Tal5–gRNA), crRNA–16 gây bất hoạt hoàn toàn gen SW14–TBR.
Nhiều nghiên cứu đã tiến hành tối ưu các bộ quy tắc để thiết kế trình tự crRNA cũng như củng cố cơ sở dữ liệu về họ tracrRNA và họ gen Cas9 để tối ưu hóa hệ thống CRISPR/Cas9 [23, 27]. Bên cạnh đó, nhiều phần mềm tin sinh đã được thiết lập cho phép thiết kế sgRNA cho đối tượng nghiên cứu, phân tích khả năng nhắm mục tiêu của sgRNA… [26, 58]. Qua đó các nhà nghiên cứu có thể dễ dàng thiết lập một công cụ chỉnh sửa hệ gen đối với bất kỳ đối tượng sinh vật nào. Trong nghiên cứu này, các công cụ tin sinh học đã được sử dụng để xác định ra 3 crRNA (TalC– gRNA, Tal5–gRNA, crRNA–16) hiệu quả/đặc hiệu nhất cho việc gây đột biến promoter SW14–TBR bằng công nghệ CRISPR/Cas9. Kết quả trên đây là cơ sở cho nghiên cứu tạo ra cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR phục vụ mục tiêu cải thiện tính kháng bệnh bạc lá của giống lúa TBR225.
3.3.2. Thiết kế cấu trúc biểu hiện sgRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR
Trong số 3 trình tự crRNA đã được thiết kế phù hợp cho nghiên cứu chỉnh sửa promoter SW14–TBR (mục 3.3.1), crRNA–16 có đích tác động là Exon I của gen OsSWEET14 và có thể gây bất hoạt gen này, do đó gây ảnh hưởng đến hoạt động
trao đổi chất trong điều kiện bình thường (khơng có vi khuẩn Xoo xâm nhiễm) của cây lúa. Vì vậy, TalC–gRNA và Tal5–gRNA đã được ưu tiên lựa chọn để thiết kế
cấu trúc biểu hiện đồng thời hai sgRNA chỉnh sửa hai vị trí Tal5 và TalC trên
promoter SW14–TBR (Hình 2.3) bằng kỹ thuật PCR, sử dụng khuôn là vector pENTR4/gRNA (Phụ lục 4).
Đối với thí nghiệm ghép nối trình tự Tal5–gRNA vào cấu trúc biểu hiện, mồi Tal5–Rv được thiết kế chứa trình tự Tal5–gRNA ở đầu 5’ và bổ sung một phần (overlap) với đầu 5’ của mồi Tal5–Fw (Bảng 2.2) với mục đích tạo sản phẩm khuếch đại được chèn thêm trình tự Tal5–gRNA. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy phản ứng PCR vòng I sử dụng cặp mồi gRNA–Fw/Tal5–Rv cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,36 kb (Hình 3.10, giếng 2) và phản ứng PCR vòng II sử dụng cặp mồi Tal5–Fw/TalC–Rv cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,44 kb (Hình 3.10, giếng 4) đều đúng với kích thước sản phẩm đích theo tính tốn lý thuyết. Phản ứng PCR vịng III được tiến hành với khn là hỗn hợp sản phẩm PCR vịng I và II tinh sạch, sử dụng cặp mồi gRNA–Fw/TalC–Rv đã cho 1 băng DNA có kích thước 0,78 kb tương ứng với kích thước theo lý thuyết của sản phẩm khuếch đại (là tổng kích thước sản phẩm PCR vịng I và PCR vịng II).
Hình 3.10: Ghép nối trình tự Tal5–gRNA vào cấu trúc biểu hiện bằng PCR
Ghi chú: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn
DNA 1 kb; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi gRNA–Fw/Tal5–Rv (PCR vòng I); giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi Tal5–Fw/TalC–Rv (PCR vòng II); giếng 5 và 6: PCR với cặp mồi gRNA–Fw/TalC–Rv (PCR vòng III); giếng 1, 3 và 5: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2 và 4: khuôn là pENTR4–gRNA; giếng 6: khuôn là hỗn hợp sản phẩm PCR vòng I và II.
Đối với thí nghiệm ghép nối trình tự TalC–gRNA vào cấu trúc biểu hiện, mồi TalC–Rv và TalC–Fw cũng được thiết kế chứa trình tự TalC–gRNA bổ sung với
nhau tại đầu 5’ với mục đích tạo sản phẩm khuếch đại được chèn thêm trình tự TalC–gRNA. Kết quả điện di sản phẩm PCR vịng III với cặp mồi gRNA–Fw/TalC– Rv (lặp lại thí nghiệm trước) và vòng IV với cặp mồi TalC–Fw/gRNA–Rv cho 1 băng DNA tương ứng với kích thước lý thuyết lần lượt khoảng 0,78 kb và 0,19 kb (Hình 3.11, giếng 2 và 4). Tương tự, thí nghiệm PCR cuối cùng (vòng V) sử dụng cặp mồi gRNA–Fw/gRNA–Rv cũng thu được một băng DNA duy nhất trên bản điện di có kích thước xấp xỉ 0,94 kb (Hình 3.11, giếng 6), chính là tổng kích thước 2 sản phẩm PCR (vòng III và vịng IV) đã được sử dụng làm khn. Như vậy, đoạn DNA mong muốn (chứa cấu trúc biểu hiện RNA được chèn thêm trình tự Tal5– gRNA và TalC–gRNA) đã được khuếch đại thành công bằng kỹ thuật PCR từ vật liệu ban đầu là vector pENTR4/gRNA.
Hình 3.11: Ghép nối trình tự TalC–gRNA vào cấu trúc biểu hiện bằng PCR
Ghi chú: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn
DNA 1 kb; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi gRNA–Fw/TalC–Rv (PCR vòng III); giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi TalC–Fw/gRNA–Rv (PCR vòng IV); giếng 5 và 6: PCR với cặp mồi gRNA–Fw/gRNA–Rv (PCR vòng V); giếng 1, 3 và 5: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2: khn là hỗn hợp sản phẩm PCR vịng I & II; giếng 4: khn là pENTR4–gRNA; giếng 6: khuôn là hỗn hợp sản phẩm PCR vòng III và IV.
Sản phẩm PCR nhân bản cấu trúc biểu hiện đồng thời Tal5–gRNA và TalC– gRNA (gọi tắt là [Tal5–TalC]) được tinh sạch và ghép nối vào vector nhân dòng
pGEM–T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Thể biến nạp mang vector tái tổ hợp được chọn lọc bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi T7–Pro/SP6–Pro. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết từ một khuẩn lạc dương tính và được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt enzyme giới hạn.
Đối với thí nghiệm kiểm tra bằng PCR, kết quả điện di thu được băng DNA có kích thước khoảng 0,94 kb (Hình 3.12, giếng 4) và 1,15 kb (Hình 3.12, giếng 2) tương ứng với kích thước theo lý thuyết của 2 đoạn DNA cần nhân bản. Tương tự, kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn plasmid pGEM/Tal5–TalC bằng enzyme
HindIII (có vị trí nhận biết nằm trong trình tự của cặp mồi gRNA–Fw/gRNA–Rv)
cũng cho hai băng DNA đúng với kích thước theo lý thuyết lần lượt khoảng 3,0 kb và 0,94 kb (Hình 3.12, giếng 6). Các kết quả trên chứng tỏ plasmid thu được là vector tái tổ hợp pGEM/Tal5–TalC.
Hình 3.12: PCR và cắt giới hạn vector pGEM/Tal5–TalC
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (Giếng 1 – 4) PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi T7–Pro/SP6–Pro; giếng
3 và 4: PCR với cặp mồi gRNA–Fw/gRNA–Rv; giếng 1 và 3: đối chứng âm (khơng có
DNA khn); giếng 2 và 4: khuôn là pGEM/Tal5–TalC. (Giếng 5 – 6) Cắt plasmid tái
tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn; giếng 5: vector pGEM/Tal5–TalC nguyên bản; giếng 6: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Trong các nghiên cứu tương tự, để thiết kế cấu trúc biểu hiện sgRNA mang trình tự crRNA đặc trưng, các tác giả có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như sinh tổng hợp toàn bộ cấu trúc, cắt/nối bằng enzyme cắt giới hạn và DNA ligase hay kĩ thuật PCR cải biến (overlap–extension PCR). Trong khi phương pháp sinh tổng hợp khá tốn kém và phương pháp cắt/nối DNA bị hạn chế khá nhiều bởi vị trí nhận biết của enzyme, kĩ thuật PCR cho phép ghép nối linh hoạt hơn rất nhiều. Ví dụ, Ma và nhóm nghiên cứu (2015) đã áp dụng phương pháp PCR cải biến để đưa các chuỗi crRNA mục tiêu vào cấu trúc biểu hiện sgRNA trong nghiên cứu chỉnh sửa gen ở A. thaliana bằng hệ thống CRISPR/Cas9. Hơn nữa, nhiều cấu trúc biểu hiện sgRNA (đặt dưới sự điều khiển
của promoter U3 và U6) đã được thiết kế vào cùng một vector CRISPR/Cas9 duy nhất để chỉnh sửa đồng thời nhiều vị trí khác nhau trong hệ gen cây chủ. Hệ thống vector này được chứng minh là có khả năng đồng nhất, hiệu quả và tạo ra nhiều đột biến có thể di truyền [42]. Trong nghiên cứu này, cấu trúc biểu hiện đồng thời hai sgRNA chỉnh sửa hai vị trí Tal5 và TalC trên promoter SW14–TBR (đặt dưới sự điều khiển của promoter U6.1 và U6.2) cũng đã được tạo ra bằng kỹ thuật PCR sử dụng hai cặp mồi khảm (chimeric primers) chứa trình tự crRNA nhắm mục tiêu EBE Tal5 và TalC từ vật liệu là vector pENTR4/gRNA. Cấu trúc này ([Tal5–TalC]) cũng đã được nhân dòng vào vector pGEM–T để sử dụng cho nghiên cứu tạo vector biểu hiện hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter SW14–TBR.
3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa promoter
SW14–TBR
Hệ thống CRIPSR/Cas được phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ với khả năng làm suy giảm chất nền ngoại sinh. Hệ thống này sau đó đã được phát triển để trở thành một công cụ chỉnh sửa hệ gen và được ứng dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng sinh vật với các mục đích khác nhau, ví dụ như tạo đột biến gen, điều hòa phiên mã, chèn gen ngoại lai, bất hoạt (knock–out) gen… [40]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về chỉnh sửa gen thực vật sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 vẫn còn khá khiêm tốn so với nghiên cứu tương tự trên các đối tượng động vật, vi khuẩn... Năm 2013, ba nhóm nghiên cứu độc lập đã đồng thời công bố kết quả nghiên cứu sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen ở thực vật [36, 49, 62]. Sau đó, hàng loạt các nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả và tiềm năng của công nghệ CRISPR/Cas9 trong chỉnh sửa gen trên cây mơ hình và cây ngũ cốc [10, 43, 74]. Trong nghiên cứu này, với mục tiêu chỉnh sửa promoter SW14–TBR bằng hệ thống CRISPR/Cas9, cấu trúc [Tal5–
TalC] trong vector pGEM/Tal5–TalC đã được ghép nối vào vị trí nhận biết của
HindIII trên vector chuyển gen thực vật pCas9 mang cấu trúc
[Ubiquitin:Cas9:35SNOS] (biểu hiện protein Cas9) để tạo ra vector chuyển gen thực
vật mang cấu trúc biểu hiện phức hệ protein/RNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR. Trình tự cặp mồi gRNA–Fw/gRNA–Rv nhân bản cấu trúc [Tal5–TalC] (Bảng 2.2) khi thiết kế đã được bổ sung vị trí nhận biết của HindIII, vì vậy vector pGEM/Tal5–
TalC được xử lý với HindIII để giải phóng cấu trúc [Tal5–TalC]. Đoa ̣n DNA này sau đó được ghép nối với vector pCas9 mạch thẳng đã được xử lý trước đó bằng HindIII và loại bỏ nhóm phosphate ở đầu 5’ bằng alkaline phosphatase.
Hình 3.13: Cắt giới hạn vector pGEM/Tal5–TalC và pCas9
Ghi chú: Sản phẩm cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1: sản
phẩm cắt giới hạn vector pCas9 bằng HindIII; giếng 2: vector pCas9 nguyên bản; giếng 3: vector pGEM/Tal5–TalC nguyên bản; giếng 4: sản phẩm cắt giới hạn vector pGEM/Tal5–TalC bằng HindIII. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn pCas9 bằng HindIII trên gel agarose 1% cho thấy đã thu được hai băng DNA có kích thước lần lượt khoảng 1,7 kb và 15,8 kb tương ứng với kích thước theo lý thuyết của đoạn DNA mang gen chọn lọc (ccdB và
ChlR) và khung vector pCas9 mạch thẳng. Tương tự, sản phẩm phản ứng cắt giới hạn
pGEM/Tal5–TalC bằng HindIII cũng cho hai băng DNA, trong đó băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,94 kb tương ứng với kích thước của cấu trúc [Tal5–TalC] (Hình 3.13, giếng 1 và 4). Hai đoạn DNA 15,8 kb và 0,94 kb được tinh sạch từ gel agarose và ghép nối với nhau bằng T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Các thể biến nạp xuất hiện trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh