Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. HỆ THỐNG CHỈNH SỬA GEN CRISPR/Cas9
1.4.3. Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong chỉnh sửa gen thực vật
Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 mới ra đời vài năm gần đây nhưng đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng công nghệ này. Kể từ khi CRISPR xuất hiện, nó đã làm cho cơng nghệ gen trở nên đơn giản hơn rất nhiều, được ứng dụng ở hầu hết sinh vật mơ hình từ cá ngựa vằn đến lúa hay động vật bậc cao như khỉ. Hệ gen của nhiều loài thực vật cũng đã được sửa đổi thông qua công nghệ CRISPR/Cas9. Cây trồng được chỉnh sửa bằng CRISPR/Cas9 được cho là vượt qua nhiều rào cản về xếp loại cây trồng biến đổi gen. Cây cà chua được chỉnh sửa bằng CRISPR/Cas9 được đự đoán sẽ tăng cường hương vị, hàm lượng đường và mùi thơm so với các giống thương mại hiện tại; ngô được tăng cường chống chịu hạn hán với năng suất cao trên mỗi ha; lúa mì được chỉnh sửa để kháng lại bệnh phấn trắng, và nấm được chỉnh sửa với mục tiêu giảm hàm lượng melanin… [10, 43].
Cùng với sự phổ biến của công nghệ chỉnh sửa gen, rất nhiều biến thể khác nhau của hệ thống CRISPR/Cas9 đã được ra đời. Đối với hệ thống CRISPR/Cas9 cơ bản, protein Cas9 cắt DNA sợi đơi và kích hoạt hệ thống sửa chữa đứt gãy sợi đơi (DSB) của tế bào. DSB có thể được sửa chữa bằng con đường NHEJ hoặc HR. Cong và các đồng nghiệp đã đưa hệ thống Cas9 tiến thêm một bước để tăng độ chính xác bằng cách phát triển một dạng đột biến, được gọi là Cas9D10A, với hoạt tính nickase (cắt trên một mạch của DNA sợi đơi). Cas9 nickase được dẫn đường bởi hai sgRNA tại hai vị trí liền kề quanh vị trí đích tạo ra một đứt gãy đơn trên mỗi chuỗi DNA. Đứt gãy đơn trên DNA khơng kích hoạt NHEJ, thay vào đó, khi được cung cấp một đoạn
DNA tương đồng, việc sửa chữa DNA chỉ được thực hiện thông qua con đường HR có độ chính xác cao, giúp giảm đột biến indel. Chính vì vậy, tính đặc hiệu của Cas9D10A cao hơn Cas9 cơ bản rất nhiều. Biến thể thứ hai là hệ thống sử dụng Cas9 bị đột biến mất hoạt tính nuclease (dCas9). Bằng cách kết hợp với các domain khác nhau, dCas9 có thể được sử dụng làm cơng cụ hoạt hóa gen (liên kết với domain hoạt hóa phiên mã), bất hoạt gen (liên kết với domain ức chế phiên mã), đánh dấu hệ gen (liên kết với phân tử chỉ thị)… [10, 43].