Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Nhân dòng promoter SW14–TBR vào vector pGEM–T
2.2.4.1. Nhân bản promoter SW14–TBR bằng PCR
Đoạn promoter SW14–TBR được nhân bản từ DNA tổng số của cây lúa non bằng kỹ thuật PCR (mục 2.2.2.3), sử dụng cặp mồi SW14–Fw/SW14–Rv (Bảng 2.2). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 0,5 µl DNA khn, 1 µl mỗi loại mồi, 2,5 µl đệm Taq DNA polymerase 10 X, 2,5 µl dNTP 2 mM, 1 µl Taq DNA polymerase, 17,5 µl nước cất khử trùng khử ion. Phản ứng được thực hiện 35 chu kỳ: biến tính DNA ở 95oC – 30 giây, gắn mồi ở 55oC – 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72oC – 1 phút. Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose theo quy trình đã trình bày ở trên (mục 2.2.2.4). Sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Thermo Fisher Scientific) theo quy trình hướng dẫn (mục 2.2.2.5). Mẫu
DNA tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose (mục 2.2.2.4) và được bảo quản ở –20°C.
2.2.4.2. Ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEM–T
Sản phẩm PCR nhân bản đoạn promoter SW14–TBR được nhân dịng vào vector pGEM–T theo quy trình hướng dẫn đi kèm bộ kit (Promega). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 1 µl sản phẩm PCR tinh sạch, 1 µl vector pGEM–T mạch thẳng (50 ng), 5 µl đệm 2 X, 1 µl T4 DNA ligase (3 U/µl) và 2 µl nước cất khử trùng khử ion. Hỗn hợp phản ứng ghép nối DNA được ủ ở 4oC qua đêm.
2.2.4.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào vi khuẩn E. coli
Sản phẩm phản ứng ghép nối đoạn promoter SW14–TBR vào vector pGEM– T được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α bằng sốc nhiệt [60]. Tế bào E. coli DH5α khả biến (bảo quản trong tủ lạnh sâu –80°C) được làm tan trên đá trong 5 – 10 phút. Sau đó, hỗn hợp phản ứng ghép nối được bổ sung vào dung dịch tế bào; ống được ủ trên đá trong 20 phút. Tế bào được sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó được chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút. 500 µl LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp biến nạp; tế bào được ủ ở 37°C trong 20 phút trước khi được ni lắc với tốc độ 220 vịng/phút trong 40 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung chất kháng sinh thích hợp và được ủ ở 37°C qua đêm.
2.2.4.4. Sàng lọc thể biến nạp bằng PCR
Thể biến nạp xuất hiện trên mơi trường chọn lọc có màu trắng được kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi T7–Pro/SP6–Pro. Một khuẩn lạc dương tính được chọn ngẫu nhiên để tách chiết DNA plasmid theo quy trình đã trình bày (mục 2.2.2.1).
2.2.4.5. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR và xử lý với enzyme cắt giới hạn
Plasmid sau khi tinh sạch được kiểm tra lần thứ nhất bằng phương pháp PCR lần lượt với hai cặp mồi SW14–Fw/SW14–Rv và T7–Pro/SP6–Pro (Bảng 2.2). Plasmid tinh sạch được kiểm tra lần thứ hai bằng cách xử lý với enzyme cắt giới hạn EcoRI, BglII và
NdeI. Hỗn hợp phản ứng cắt giới hạn bao gồm: 5 µl DNA plasmid, 1 µl đệm 10 X, 1 µl
enzyme cắt giới hạn và 3 µl nước cất khử trùng khử ion. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 1 giờ, sau đó được chuyển sang ủ ở 65oC trong 15 phút để ngừng phản ứng. Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di kiểm tra như trong mục 2.2.2.4.
Hình 2.2: Sơ đồ vector pGEM/SW14–TBR
Ghi chú: (NdeI, BglII, EcoRI): các enzyme cắt giới hạn; SW14–TBR: promoter
2.2.4.6. Giải trình tự DNA
Vector pGEM/SW14–TBR được giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự ABI3100 theo phương pháp của Smith và nhóm nghiên cứu (1986) [64]. Cụ thể, phản ứng PCR giải trình tự DNA được tiến hành qua 2 bước: bước PCR thông thường để khuếch đại đoạn DNA cần đọc và bước PCR thứ hai để xác định trình tự. Trong đó, PCR thơng thường sử dụng khuôn là vector pGEM/SW14–TBR với cặp mồi T7– Pro/SP6–Pro. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch, pha lỗng ở nồng độ thích hợp và dùng làm khn cho PCR xác định trình tự. Về cơ bản, PCR xác định trình tự có các thành phần giống như PCR thơng thường nhưng có một số khác biệt là sự có mặt của ddNTP (ít hơn dNTP 1 nhóm 3’–OH) và chỉ cần dùng một loại mồi (T7–Pro hoặc SP6–Pro). Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đưa ra trình tự của đoạn DNA gốc. Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit 4.0. Trình tự DNA sau khi xử lý được so sánh với cơ sở dữ liệu trên GenBank và phân tích bằng phần mềm Genetyx 4.0.