Ghi chú: Sản phẩm cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1: sản
phẩm cắt giới hạn vector pCas9 bằng HindIII; giếng 2: vector pCas9 nguyên bản; giếng 3: vector pGEM/Tal5–TalC nguyên bản; giếng 4: sản phẩm cắt giới hạn vector pGEM/Tal5–TalC bằng HindIII. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn pCas9 bằng HindIII trên gel agarose 1% cho thấy đã thu được hai băng DNA có kích thước lần lượt khoảng 1,7 kb và 15,8 kb tương ứng với kích thước theo lý thuyết của đoạn DNA mang gen chọn lọc (ccdB và
ChlR) và khung vector pCas9 mạch thẳng. Tương tự, sản phẩm phản ứng cắt giới hạn
pGEM/Tal5–TalC bằng HindIII cũng cho hai băng DNA, trong đó băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,94 kb tương ứng với kích thước của cấu trúc [Tal5–TalC] (Hình 3.13, giếng 1 và 4). Hai đoạn DNA 15,8 kb và 0,94 kb được tinh sạch từ gel agarose và ghép nối với nhau bằng T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Các thể biến nạp xuất hiện trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh spectinomycin được sàng lọc bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi pCas9– Fw/pCas9–Rv. Kết quả thu được cho thấy một số sản phẩm PCR từ khuẩn lạc khi được điện di trên gel agarose 1% đều cho 1 băng DNA duy nhất có kích thước xấp xỉ 1,2 kb (Hình 3.14, giếng 3 – 6, 9, 11 và 12) tương ứng với kích thước theo lý thuyết bao gồm đoạn cấu trúc [Tal5–TalC] (xấp xỉ 0,94 kb) và đoạn trình tự giữa hai mồi
pCas9–Fw và pCas9–Rv trên khung vector pCas9 mạch thẳng (có khoảng cách 325 bp). Tương tự, phản ứng đối chứng dương (khuôn là vector pCas9 nguyên bản) cho sản phẩm chứa 1 băng DNA có kích thước xấp xỉ 2,0 kb (Hình 3.14, giếng 2) cũng đúng với kích thước theo tính tốn lý thuyết. Ngược lại, phản ứng đối chứng âm (khuôn là khuẩn lạc không được biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC) không cho sản phẩm DNA nào. Kết quả này chứng tỏ các thể biến nạp thu được có thể đã mang vector tái tổ hợp pCas9/Tal5–TalC.
Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc được biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi pCas9–Fw/pCas9–Rv được
điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: đối chứng âm (khuẩn lạc không được biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC; giếng 2: đối chứng dương: khuôn là pCas9; giếng 3 – 12: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC số 1 – 10.
Plasmid tái tổ hợp được tách chiết từ thể biến nạp dương tính và kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA đích bằng phương pháp PCR và phương pháp xử lý với enzyme cắt giới hạn. Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tinh sạch bằng cặp mồi pCas9– Fw/pCas9–Rv (đặc hiệu cho vector pCas9) và cặp mồi Tal5–Fw/TalC–Rv (đặc hiệu cho cấu trúc [Tal5–TalC]) khi được điện di trên gel agarose 1% cho các băng DNA có kích thước lần lượt khoảng 1,3 kb và 0,44 kb (Hình 3.15A, giếng 2 và 4). Đồng thời, sản phẩm PCR plasmid pCas9/Tal5–TalC bằng cặp mồi Ubi–Fw/NOS–Rv đặc hiệu cho vector pCas9/Tal5–TalC và cặp mồi Cas9–Fw/Cas9–Rv đặc hiệu cho gen
Cas9 cho các băng DNA có kích thước lần lượt khoảng 4,3 kb và 4,1 kb trên bản điện
di (Hình 3.15A, giếng 6 và 8). Kích thước của các băng DNA thu được này hoàn toàn phù hợp với kích thước theo tính tốn lý thuyết của đoạn DNA cần nhân bản. Mặt
khác, khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn HindIII, kết quả điện di cho 2 băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,94 kb và 15,8 kb (Hình 3.15B, giếng 2) tương ứng với kích thước của cấu trúc [Tal5–TalC] và khung vector pCas9. Các kết quả này
chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pCas9/Tal5–TalC thu được có mang đồng thời cấu trúc biểu hiện gen Cas9 (điều khiển bởi promoter Ubiquitin) và cấu trúc biểu hiện Tal5– gRNA và TalC–gRNA (được điều khiển bởi promoter U6.1 và U6.2).
Hình 3.15: PCR và cắt giới hạn vector pCas9/Tal5–TalC
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
vector tái tổ hợp; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi pCas9–Fw/pCas9–Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi Tal5–Fw/TalC–Rv; giếng 5 và 6: PCR với cặp mồi Ubi– Fw/NOS–Rv; giếng 7 và 8: PCR với cặp mồi Cas9–Fw/Cas9–Rv; giếng 1, 3, 5 và 7: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2, 4, 6 và 8: khn là vector pCas9/Tal5–
TalC. (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn; giếng 1: vector
pCas9/Tal5–TalC nguyên bản; giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Để khẳng định chính xác đoạn DNA được ghép nối vào vector pCas9 đúng là cấu trúc [Tal5–TalC] và khơng xảy ra đột biến trong q trình ghép nối, vector tái tổ hợp pCas9/Tal5–TalC được giải trình tự và phân tích kết quả bằng phần mềm BioEdit (Hình 3.16). Kết quả phân tích trình tự nucleotide cho thấy đoạn DNA được ghép nối vào pCas9 có kích thước 1268 bp, mang đầy đủ và chính xác 2 cấu trúc biểu hiện Tal5–gRNA và TalC–gRNA đặt dưới sự điều khiển lần lượt của promoter U6.1 và U6.2 theo như tính tốn lý thuyết (Hình 3.16A–B). Các kết quả thu được này cho phép khẳng định chắc chắn cấu trúc [Tal5–TalC] đã được chèn thành công vào vector pCas9.
Hình 3.16: Giải trình tự vector tái tổ hợp pCas9/Tal5–TalC
Ghi chú: Một phần kết quả giải trình tự pCas9/Tal5–TalC với mồi gRNA–Fw (A), mồi gRNA–Rv (B), mồi Ubi–Fw (C). Một phần trình tự promoter U6.1(A), U6.2 (B)
và Ubiquitin (C) được thể hiện bằng mũi tên (→ ); trình tự Tal5–gRNA (A), TalC– gRNA (B) và mồi Cas9–Fw (C) được bơi đen; một phần trình tự tracrRNA (A và B) được thể hiện bằng dấu sao (*); một phần khung đọc mở gen Cas9 được thể hiện
bằng dấu cộng (+).
3.4. NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC CHỈNH SỬA PROMOTER SW14–
TBR VÀO GIỐNG LÚA TBR225
3.4.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens EHA105
Để tạo vật liệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen vào cây lúa, vector pCas9/Tal5–TalC được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 bằng phương pháp sốc nhiệt (mục 2.2.6). Bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc sử dụng cặp mồi pCas9–Fw/Tal5–Fw, một số dòng tế bào vi khuẩn A. tumefaciens có
mang Ti–plasmid chứa cấu trúc [Tal5–TalC] đã được xác định. Cụ thể, sản phẩm PCR với khuôn khuẩn lạc A. tumefaciens được biến nạp pCas9/Tal5–TalC cho một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 1,1 kb trên bản điện di (Hình 3.17, giếng 3–7), đúng với kích thước theo tính tốn lý thuyết, tương tự như sản phẩm PCR đối chứng dương sử dụng khn là vector pCas9/Tal5–TalC (Hình 3.17, giếng 3). Ngược lại, sản phẩm PCR từ vi khuẩn A. tumefaciens không được biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC khơng thu được bằng DNA này (Hình 3.17, giếng 1). Dựa trên kết quả này, có thể kết luận vector pCas9/Tal5–TalC đã được biến nạp thành công vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Các thể biến nạp có kết quả PCR dương tính được bảo quản để sử dụng
cho thí nghiệm chuyển gen vào giống lúa TBR225 sau này.
Hình 3.17: PCR trực tiếp khuẩn lạc A. tumefaciens được biến nạp vector
pCas9/Tal5–TalC
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi pCas9–Fw/Tal5–Fw được
điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: đối chứng âm (khuẩn lạc không được biến nạp DNA); giếng 2: đối chứng dương (khuôn là vector pCas9/Tal5–TalC); giếng 3 – 7: khuôn là khuẩn lạc được biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC số 1 – 5.
3.4.2. Chuyển cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR vào giống lúa TBR225
Trước đây, phương pháp chuyển gen thực vật thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được áp dụng thành công ở nhiều đối tượng cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả chuyển gen ở cây một lá mầm (lúa, ngơ, lúa mì...) cịn thấp. Từ năm 1993, các nhà khoa học đã thành công trong việc sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens để chuyển gen vào lúa Oryza sativa L. ssp. japonica, sau đó phương pháp chuyển gen này đã được cải tiến
vi khuẩn A. tumefaciens vẫn là một thách thức lớn. Năm 2008, Hiei và Komari đã phát triển một phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens vào lúa Indica bằng cách sử dụng phôi non và thu được hiệu quả rất cao (5 – 13 thể biến nạp/phơi non) [19]. Nhóm nghiên cứu của “Dự án chọn tạo giống lúa TBR225 kháng bệnh bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen” đã tiến hành chuyển cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR (vector pCas9/Tal5–TalC) vào phôi non của lúa TBR225 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (Hình 3.18) (số liệu chưa được cơng bố). Trong khn khổ luận văn này, 7 dòng lúa tái sinh (D1.1 – 1.7) trên mơi trường ni cấy chọn lọc (có bổ sung chất kháng sinh hygromycin) đã được sử dụng để xác định khả năng tích hợp vào hệ gen lúa TBR225 của cấu trúc T–DNA đã thiết kế.
Hình 3.18: Chuyển cấu trúc T–DNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR vào giống lúa TBR225
Ghi chú: (A) Đồng nuôi cấy phôi non với vi khuẩn A. tumefaciens được biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC. (B) Nuôi cấy mô sẹo (callus) trên mơi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin 30 mg/l. (C) Tái sinh chồi từ mô sẹo trên mơi trường tái sinh có hygromycin 30 mg/l. (D) Tái sinh rễ từ đoạn thân trên môi trường tái sinh rễ.
Các dòng lúa tái sinh được tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc chỉnh sửa gen bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho vector pCas9/Tal5–TalC.
Hình 3.19: Xác định sự có mặt của gen chọn lọc HygR bằng PCR
Ghi chú: Sản phẩm PCR với cặp mồi Actin–Fw/Actin–Rv (A) và cặp mồi Hyg– Fw/Hyg–Rv (B) được điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb;
giếng 1: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2: đối chứng âm (khuôn là mẫu DNA tách chiết từ cây lúa TBR225 không chuyển gen); giếng 3 – 9: khuôn là mẫu DNA tách chiết từ các dòng lúa TBR225 được chuyển cấu trúc pCas9/Tal5–TalC (D1.1 – 1.7); giếng 10: đối chứng dương (khuôn là vector pCas9/Tal5–TalC).
Kết quả PCR kiểm tra mẫu DNA tách chiết từ các cây lúa TBR225 với cặp mồi đặc hiệu cho gen nội chuẩn Actin (Actin–Fw/Actin–Rv) đều thu được kết quả dương tính, sản phẩm PCR cho 1 băng DNA rõ nét khi được điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.19A, giếng 2 – 9), chứng tỏ tất cả mẫu DNA tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên, khi kiểm tra các cây lúa tái sinh bằng cặp mồi đặc hiệu cho gen chọn lọc Hygromycin phosphotransferase (gọi tắt là HygR) (Hyg–Fw/Hyg–Rv), chỉ có 3/7 dịng lúa tái sinh được kiểm tra (D1.1, D1.5 và D1.6) cho kết quả dương tính, sản phẩm PCR trên bản điện di cho 1 băng DNA đặc hiệu có kích thước xấp xỉ 0,8 kb (Hình 3.19B, giếng 3, 7 và 8), đúng với kích thước tính tốn lý thuyết của đoạn DNA được nhân bản trên vector pCas9/Tal5–TalC (Hình 3.19B, giếng 10). Ngược lại, các thí nghiệm PCR sử dụng khn là mẫu DNA tách chiết từ các dòng lúa D1.2,
D1.3, D1.4, D1.7 và cây lúa TBR225 không chuyển gen, sản phẩm PCR khơng thu được băng DNA này. Như vậy, có thể thấy mặc dù tái sinh được trên mơi trường có hygromycin nhưng khơng phải tất cả các dịng cây tái sinh đều mang gen HygR. Kết quả trên đây cho thấy hiệu quả chọn lọc của chất kháng sinh trong thí nghiệm chuyển gen chưa cao, tỉ lệ dương tính giả xấp xỉ 57%.
Hình 3.20: Xác định sự có mặt của cấu trúc biểu hiện phức hệ chỉnh sửa
SW14–TBR bằng PCR
Ghi chú: Sản phẩm PCR với cặp mồi Tal5–Fw/TalC–Rv (A) và cặp mồi Ubi– Fw/Cas9–Rv2 (B) được điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA
1 kb; giếng 1 – 3: khuôn là mẫu DNA tách chiết từ các dòng lúa D1.1, D1.5 và D1.6; giếng 4: đối chứng âm (khuôn là mẫu DNA tách chiết từ cây lúa TBR225 không chuyển gen); giếng 5: khuôn là pCas9/Tal5–TalC; giếng 6: đối chứng âm (khơng có DNA khn).
Để đảm bảo chắc chắn 3 dòng lúa tái sinh D1.1, D1.5 và D1.6 thu được có mang cấu trúc biểu hiện phức hệ protein/RNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR
trong hệ gen, các dòng lúa này tiếp tục được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi Tal5– Fw/TalC–Rv đặc hiệu cho cấu trúc [Tal5–TalC] và Ubi–Fw/Cas9–t–Rv đặc hiệu cho cấu trúc [Ubiquitin:Cas9:35SNOS]. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy 2 dòng D1.1 và D1.5 đã cho băng DNA có kích thước đúng với kích thước tính tốn lý thuyết tương tự mẫu đối chứng dương (sử dụng khuôn là pCas9/Tal5–TalC): băng DNA 0,44 kb được nhân bản từ cấu trúc [Tal5–TalC] (Hình 3.20A, giếng 1 và 2) và băng DNA 0,36 kb được nhân bản từ cấu trúc
[Ubiquitin:Cas9:35SNOS] (Hình 3.20B, giếng 1 và 2). Ngược lại, mẫu DNA tách
chiết từ dịng D1.6 và dịng lúa TBR225 khơng chuyển gen cho kết quả PCR âm tính với các cặp mồi này (Hình 3.19A, giếng 3 và 4). Việc dịng D1.6 có mang gen
HygR nhưng không phát hiện được sự có mặt của cấu trúc biểu hiện sgRNA và
Cas9 có thể giải thích là do đã xảy ra hiện tượng đứt gãy trong quá trình tái tổ hợp DNA, dẫn tới chỉ có một phần cấu trúc Ti–DNA (chứa gen HygR) được chèn vào hệ gen của cây lúa.
Như vậy, có thể bước đầu khẳng định cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR đã được tích hợp vào hệ gen lúa TBR225. Các dòng lúa chuyển gen sẽ được tiếp túc phân tích sâu hơn về đặc điểm kiểu gen và kiểu hình để chứng minh khả năng hoạt động của cấu trúc đã thiết kế và làm rõ vai trò của gen OsSWEET14 đối với cơ chế xâm nhiễm của các chủng vi khuẩn Xoo đại diện trên giống lúa TBR225.
Cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR mặc dù đã được xác định có mặt trong cây chuyển gen bằng phương pháp PCR nhưng protein quan tâm có được biểu hiện trong cây chuyển gen hay khơng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, ví dụ như vị trí chèn cấu trúc biểu hiện gen đích, số bản sao của gen đích trong hệ gen cây chủ… [12]. Đồng thời, hệ thống chỉnh sửa promoter SW14–TBR sau khi được biểu hiện phải có được hoạt tính như mong muốn mới chứng tỏ được sự thành cơng của các thí nghiệm trước đó. Do đó, các thí nghiệm chi tiết về trình tự promoter SW14–TBR trong các
dòng lúa TBR225 chuyển gen là rất cần thiết.
Cho đến nay theo ước tính của Thermo Fisher, đã có hơn 21000 bài báo về chủ đề chỉnh sửa hê ̣ gen được đăng tải. Trong những năm gần đây, CRISPR/Cas trở thành hệ thống được lựa chọn hàng đầu cho kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen ở nhiều sinh vật. Trong đó, số bài báo mới và các ứng du ̣ng mới được công bố của phức hợp CRISPR/Cas9 đang tăng lên từ ng ngày. Kết quả thu được từ các nghiên cứu đã cho thấy tính trực giao, linh hoạt và hiệu quả của hệ thống này. Với những ưu điểm đó, CRISPR/Cas9 được ứng dụng phổ biến không chỉ trong lĩnh vực y tế mà cịn cả trong lĩnh vực sinh học nơng nghiệp để phục vụ nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau (như nghiên cứu chức năng gen, cải tạo giống cây trồng…). Từ sau năm 2013 đã có rất nhiều nghiên cứu chỉnh sửa gen ở thực vật bằng hệ thống CRISPR/Cas9 được thực hiện [10, 40, 43, 74]. Trong nghiên cứu này, cấu trúc chỉnh sửa promoter OsSWEET14
TBR225 (Oryza sativa L.) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của “Dự án chọn tạo giống lúa TBR225 kháng bệnh bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen”), cấu trúc chuyển gen đã được xác định có mặt trong một số dịng lúa tái sinh bằng PCR. Tuy nhiên, tỉ lệ dòng lúa tái sinh mang đầy đủ các gen đích chưa cao (2/7 mẫu kiểm tra). Khả năng xuất hiện đột biến sau quá trình sửa DNA đứt gãy theo cơ chế NHEJ của tế bào có tính ngẫu nhiên. Chính vì vậy, để tăng khả năng thu được đột biến mong muốn, quy trình chuyển gen vào giống lúa TBR225 cần được cải tiến nhằm thu được nhiều dòng lúa mang cấu trúc biểu hiện gen đích. Trong khn khổ của luận văn này, chúng tôi bước đầu chứng minh được giống lúa TBR225 có khả năng tiếp nhận cấu trúc biểu hiện phức hệ protein/RNA CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter SW14–TBR.
Việc chỉnh sửa vị trí bám trên promoter “gen mẫn cảm” cho các protein TAL của Xanthomonas oryzae pv. oryzae là một chiến lược kiểm soát biểu hiện gen. Một số cơng nghệ trước đây cũng cho phép kiểm sốt biểu hiện gen của cây chủ như bất hoạt gen bằng virus (virus–induced gene silencing) hay RNAi (RNA interference) nhưng theo cơ chế tương tác mRNA của gen đích. Mặc dù được áp dụng rộng rãi cho các nghiên cứu chức năng gen ở thực vật, nhưng sự kiểm sốt biểu hiện gen thơng qua mRNA xảy ra là gián tiếp và tác dụng chỉ đạt một phần. Vì thế, chiến lược kiểm sốt trực tiếp biểu hiện gen đích thơng qua việc tạo đột biến trên hệ gen được cho là có hiệu quả hơn cả. Hiện nay việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 đã cho phép gây