Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Đánh giá độc tính của vi khuẩn Xoo trên giống lúa TBR225
Thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn Xoo đươc thực hiện theo phương pháp cắt lá cải tiến của Ke và nhóm nghiên cứu (2017) [78].
Vi khuẩn Xoo (lưu trữ ở –80oC) được cấy trải trên môi trường PSA đặc, sau đó đĩa thạch được ủ ở 28oC trong 3 ngày. Khuẩn lạc được kiểm tra lại bằng phản ứng PCR (mục 2.2.2.3) với cặp mồi đặc hiệu Xoo–Fw/Xoo–Rv (Bảng 2.2). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 0,5 µl khn, 1 µl mỗi loại mồi, 2,5 µl đệm Taq DNA polymerase 10 X, 2,5 µl dNTP 2 mM, 1 µl Taq DNA polymerase, 17,5 µl nước cất khử trùng khử ion. Phản ứng được thực hiện 35 chu kỳ: biến tính DNA ở 95oC – 30 giây, gắn mồi ở 55oC – 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72oC – 30 giây. Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose theo quy trình đã trình bày ở trên (mục 2.2.2.4). Vi khuẩn được cấy chuyển sang đĩa môi trường PSA đặc mới và tiếp tục được ủ ở 28oC trong 2 ngày. Tiếp theo, sinh khối vi khuẩn Xoo trên bề mặt môi
trường ni cấy được thu lại và pha lỗng trong dung dịch MgCl2 10 mM đã khử trùng đến giá trị OD600 đạt 0,5.
Để lây nhiễm vi khuẩn Xoo, đầu phiến lá (3 – 4 cm) của cây lúa TBR225 (mục 2.2.1) được cắt bằng kéo đã được nhúng trong dung dịch vi khuẩn Xoo (Hình 2.1A – D). Thí nghiệm đối chứng âm sử dụng dung dịch MgCl2 10 mM không chứa vi khuẩn Xoo. Giống IR24 được dùng làm mẫu chuẩn nhiễm vi khuẩn Xoo (đối chứng dương) [50]. Sau 14 ngày, chiều dài vết bệnh phát triển trên lá lúa được ghi lại (Hình 2.1E). Chiều dài vết bệnh được tính là chiều dài từ vị trí cắt đến rìa của các vết tổn thương (cháy lá) hoàn toàn trên lá lúa. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần trên ít nhất 3 cây (lá thứ nhất và lá thứ hai trên mỗi nhánh của cây). Kết quả được xử lý thống kê và xây dựng đồ thị trên phần mềm Excel.
Hình 2.1: Lây nhiễm vi khuẩn Xoo trên lúa bằng phương pháp cắt lá [78] Ghi chú: (A) Cây lúa ở giai đoạn đẻ nhánh; (B) Nhúng kéo vào ống chứa dung dịch Ghi chú: (A) Cây lúa ở giai đoạn đẻ nhánh; (B) Nhúng kéo vào ống chứa dung dịch
hịa lỗng vi khuẩn (MgCl2 10 mM); (C – D) Sử dụng kéo cắt bỏ phần đầu phiến lá
lúa; (E) Xác định chiều dài vết bệnh.