Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Thiết kế cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR
2.2.5.1. Thiết kế trình tự sgRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR
Trình tự sgRNA đặc hiệu chỉnh sửa promoter SW14–TBR được thiết kế bằng phần mềm CRISPR MultiTargeter [86]. Hàm lượng GC của các sgRNA được phân tích bằng phần mềm Genetyx 4.0. Cấu trúc bậc II của các sgRNA được phân tích bằng phầm mềm Mfold 2.3 [84]. Tính đặc hiệu của các trình tự crRNA (on/off–target) của phức hệ Cas9/sgRNA được phân tích bằng cơng cụ CRISPR trong phần mềm Benchling [89]. Đoạn DNA giống/gần giống với các sgRNA trong hệ gen lúa được xác định bằng phần mềm phần mềm CCTop [90]. Trình tự hệ gen lúa được tham chiếu từ cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen Ensembl Plants [83]. Đoạn sgRNA đặc hiệu được lựa chọn dựa trên vị trí trên promoter SW14–TBR, hàm lượng GC, khả năng hình thành và duy trì cấu trúc bậc II, số lượng và vị trí đoạn DNA giống/gần gống xuất hiện trong hệ gen lúa, vị trí và số lượng Nu sai khác trên sgRNA [38].
2.2.5.2. Thiết kế cấu trúc biểu hiện sgRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR
Cấu trúc biểu hiện sgRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR được thiết kế từ
[55]. Hỗn hợp mỗi phản ứng bao gồm: 0,5 µl DNA khn, 1 µl mỗi loại mồi, 2,5 µl đệm Taq DNA polymerase 10 X, 2,5 µl dNTP 2 mM, 1 µl Taq DNA polymerase, 17,5 µl nước cất khử trùng khử ion. Phản ứng được thực hiện 35 chu kỳ: biến tính DNA ở 95oC – 30 giây, gắn mồi ở 55oC – 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72oC – 30 giây.
Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế cấu trúc [Tal5–TalC]
Ghi chú: (PCR–I, PCR–II, PCR–III, PCR–IV và PCR–V): các vòng PCR từ I – V;
(Tal5): trình tự (20 Nu) chỉnh sửa đồng thời 3 vị trí EBE AvrXa7, PthXo3 và Tal5; (TalC): trình tự (20 Nu) chỉnh sửa vị trí TalC; ([Tal5–TalC]): cấu trúc biểu hiện Tal5– gRNA và TalC–gRNA; (Pro): promoter – vùng khởi đầu phiên mã; (Ter): terminator – vùng kết thúc phiên mã; (tracrRNA): trans–encoded CRISPR RNA; (gRNA–Fw, gRNA– Rv, Tal5–Fw, Tal5–Rv, TalC–Fw, TalC–Rv): mồi sử dụng cho PCR.
Vector pENTR4/gRNA được dùng làm khn cho các phản ứng PCR vịng I và vòng II, sử dụng lần lượt các cặp mồi gRNA–Fw/Tal5–Rv và Tal5–Fw/TalC–Rv. Sản phẩm PCR (vòng I và II) tinh sạch được trộn lẫn và sử dụng làm khn cho phản ứng PCR vịng III với cặp mồi gRNA–Fw/TalC–Rv. Phản ứng PCR vòng IV được
thực hiện với khuôn là vector pENTR4–gRNA, sử dụng cặp mồi TalC–Fw/gRNA– Rv. Sản phẩm PCR vòng III và IV tiếp tục được trộn với nhau và sử dụng làm khn cho phản ứng PCR vịng V với cặp mồi gRNA–Fw/gRNA–Rv (Bảng 2.2). Sản phẩm PCR cuối cùng chứa cấu trúc biểu hiện Tal5–gRNA và TalC–gRNA (gọi tắt là
[Tal5–TalC]) được kiểm tra và tinh sạch từ bản gel agarose theo quy trình ở mục
2.2.2.4 và mục 2.2.2.5.
Sản phẩm PCR nhân bản cấu trúc [Tal5–TalC] được ghép nối vào vector
pGEM–T mạch thẳng tương tự mục 2.2.4.2 đã trình bày ở trên. Thể biến nạp được chọn lọc bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc sử dụng hai cặp mồi pCas9– Fw/pCas9–Rv (Bảng 2.2). Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt enzyme giới hạn tương tự như ở mục 2.2.4.5; trong đó thí nghiệm PCR sử dụng cặp mồi gRNA–Fw/gRNA–Rv và T7–Pro/SP6–Pro, thí nghiệm cắt giới hạn sử dụng enzyme HindIII. Sản phẩm PCR và cắt giới hạn sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (mục 2.2.2.4).
2.2.5.3. Thiết kế vector chuyển gen trong tế bào thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR
Để tạo hệ vector biểu hiện phức hệ protein/RNA chỉnh sửa promoter SW14– TBR, vector pGEM/Tal5–TalC và pCas9 được xử lý bằng enzyme HindIII. Hỗn hợp
phản ứng cắt vector pCas9 sau đó được xử lý với alkaline phosphatase trong 30 phút. Đoạn DNA [Tal5–TalC] và vector pCas9 mạch thẳng được tinh sạch sau đó được ghép nối bằng T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 1 µl sản phẩm tinh sạch đoạn DNA [Tal5–TalC], 1 µl vector pCas9 mạch thẳng, 5 µl đệm 2 X, 1 µl T4 DNA ligase (3 U/µl) và 2 µl nước cất khử trùng khử ion. Hỗn hợp phản ứng ghép nối DNA được ủ ở 4oC qua đêm. Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli khả biến tương tự như quy trình đã trình bày ở trên. Thể biến nạp được chọn lọc bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc sử dụng cặp mồi pCas9–Fw/pCas9–Rv (Bảng 2.2). Khuẩn lạc dương tính được chọn ngẫu nhiên để tách chiết plasmid và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR và cắt enzyme giới hạn tương tự như ở mục 2.2.4.5, trong đó thí nghiệm PCR sử dụng cặp mồi pCas9–Fw/pCas9–Rv, Tal5–
Fw/TalC–Rv, thí nghiệm cắt giới hạn sử dụng enzyme HindIII. Vector pCas9/Tal5– TalC được giải trình tự bằng cặp mồi pCas9–Fw và pCas9–Rv (tương tự mục 2.2.4.6).
Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCas9/Tal5–TalC
Ghi chú: Cấu trúc [Tal5–TalC] trên pGEM/Tal5–TalC được cắt và ghép nối vào vị
trí enzyme HindIII trên vector pCas9. (HygR): trình tự mã hóa Hygromycin phosphotransferase (HPT); (ccdB): gen độc gây chết tế bào vi khuẩn (control of cell death B gene); (ChlR): trình tự mã hóa Chloramphenicol acetyltransferase (CAT); (35S Ter): vùng kết thúc phiên mã 35S; (Ubiquitin): vùng khởi đầu phiên mã Ubiquitin; ([Tal5–TalC]): cấu trúc biểu hiện sgRNA–Tal5 và sgRNA–TalC; (Cas9): khung đọc mở của gen Cas9; (RB): bờ phải (right border); (LB): bờ trái (left border).
2.2.6. Biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
Vector pCas9/Tal5–TalC được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
EHA105 theo quy trình của Wang (2007) [73]. Tế bào A. tumefaciens EHA105 khả biến (bảo quản trong tủ lạnh sâu –80°C) được làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, 1 µg vector pCas9/Tal5–TalC được bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 15 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào; ống tế bào sau đó được ủ trong N2 lỏng trong 5 phút. Tế bào được sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 37oC trong 5 phút. Ống tế bào được ly tâm trong 30 giây; phần dịch nổi được loại bỏ hồn tồn. 500 µl LB được bổ sung vào ống để hịa tan tồn bộ tế bào; ống sau đó tiếp tục được ly tâm trong 30 giây; phần dịch nổi được loại bỏ. Tiếp theo, 500µl LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp, tế bào được nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong 2 – 4 giờ, ở 28°C. Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên môi
trường LB đặc có bổ sung spectinomycin 25 µg/ml, rifampicin 20 µg/ml và ủ ở 28°C trong 2 – 3 ngày. Sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen trong khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường chọn lọc được kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi pCas9–Fw/Tal5–Fw (Bảng 2.2).
2.2.7. Xác định kiểu gen của cây chuyển gen bằng PCR
DNA tổng số của các dòng lúa TBR225 tái sinh được tách chiết theo phương pháp đã nêu ở mục 2.2.2.2. Sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen đích trong cây chuyển gen được xác định bằng PCR (mục 2.2.2.3) với các cặp mồi Actin–Fw/Actin– Rv, Hyg–Fw/Hyg–Rv, Tal5–Fw/TalC–Rv và Ubi–Fw/Cas9–Rv2 (Bảng 2.2). Cây lúa TBR225 không được chuyển gen được sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (mục 2.2.2.4).
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ TÍNH MẪN CẢM CỦA LÚA TBR225 VÀ KITAAKE VỚI VI KHUẨN XOO VIỆT NAM
3.1.1. Đánh giá tính mẫn cảm của lúa TBR225 đối với các chủng vi khuẩn Xoo
thu thập tại miền Bắc Việt Nam
Các chủng vi khuẩn Xoo đã phân lập tại miền Bắc Việt Nam được nhận diện
bằng PCR trực triếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu Xoo–Fw/Xoo–Rv [7]. Kết quả trên ảnh điện di cho thấy tất cả sản phẩm PCR sử dụng khuôn là khuẩn lạc Xoo đều chứa 1 băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 0,47 kb (Hình 3.1, giếng 2 – 18) tương ứng với kích thước theo lý thuyết của trình tự đích cần nhân bản; trong khi mẫu đối chứng âm (khơng có DNA khn) khơng thu được băng DNA này (Hình 3.1, giếng 1). Như vậy tất cả các mẫu vi khuẩn gây bệnh bạc lá được sử dụng trong nghiên cứu đều là Xoo.
Hình 3.1: PCR trực tiếp khuẩn lạc Xoo
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc Xoo với cặp mồi Xoo–Fw/Xoo–Rv được
điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2 – 18: khuôn là khuẩn lạc của 17 chủng vi khuẩn Xoo.
Để đánh giá độc tính của 17 chủng vi khuẩn Xoo, cây lúa TBR225 đã được lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xoo bằng phương pháp cắt lá. Kết quả thu được sau 2 tuần lây nhiễm bệnh nhân tạo (Hình 3.2) cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn Xoo sử dụng trong nghiên cứu đều thể hiện độc tính mạnh trên giống lúa TBR225, với chiều dài vết bệnh trung bình đạt 25 cm; trong đó chủng VXO_33 thể hiện độc tính mạnh nhất (35 cm) và chủng VXO_51 thể hiện độc tính kém nhất (17 cm). Dựa trên thang điểm đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh bạc lá lúa đối với thử nghiệm trong điều kiện nhà kính của IRRI [32], kết quả trên đây cho thấy giống lúa TBR225 bị mẫn cảm với tất
cả 17 chủng vi khuẩn Xoo đã thu thập tại miền Bắc Việt Nam. Kết quả tương tự cũng thu được trong thí nghiệm lây nhiễm Xoo nhân tạo sử dụng giống lúa chuẩn nhiễm IR24 (Phụ lục 1).
Hình 3.2: Độc tính của các chủng vi khuẩn Xoo trên giống lúa TBR225 Ghi chú: Cây lúa TBR225 được lây nhiễm với 17 chủng vi khuẩn Xoo (VXO_33 – Ghi chú: Cây lúa TBR225 được lây nhiễm với 17 chủng vi khuẩn Xoo (VXO_33 –
VXO_72) bằng phương pháp cắt lá. (ĐC): đối chứng âm (cây lúa TBR225 được lây nhiễm bằng dung dịch không chứa vi khuẩn Xoo). Đồ thị biểu hiện chiều dài vết bệnh trên lá lúa sau 14 ngày lây nhiễm. Số liệu trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Nhiều phương pháp lây nhiễm nhân tạo bệnh bạc lá lúa đã được nghiên cứu và áp dụng, trong số đó phương pháp cắt kéo được chứng minh là có hiệu quả hơn cả [9, 35]. Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong các nghiên cứu đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh bạc lúa trên thế giới và tại Việt Nam [2, 5, 32, 52]. Ở miền Bắc, TBR225 là giống lúa chủ lực nhưng có nhược điểm là mẫn cảm với bệnh bạc lá, tuy nhiên hầu như chưa có nghiên cứu nào đánh giá tính kháng/nhiễm của TBR225 với các chủng Xoo của Việt Nam. Kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy TBR225 có biểu hiện bệnh bạc lá rõ rệt sau khi được lây nhiễm 17 chủng
Xoo thu thập từ một số địa phương trồng lúa phía Bắc, chứng tỏ tính mẫn cảm của
TBR225 với bệnh bạc lá.
3.1.2. Nghiên cứu vai trò của OsSWEET14 đối với quá trình lây nhiễm của vi khuẩn Xoo
Họ gen OsSWEET gồm các gen mã hóa cho các protein vận chuyển đường ở thực vật, được cho là có liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh
bạc lá lúa Xoo thơng qua q trình giải phóng phân tử đường vào gian bào
(apoplast) và cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn. Sau khi xâm nhiễm thành công, vi khuẩn tiết ra các protein đặc biệt có khả năng hoạt hóa sự biểu hiện các gen
SWEET khác nhau, từ đó kiểm sốt dịng chảy chất dinh dưỡng trong cây chủ [21,
20]. Một số gen như OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14 đã được xác định là đích tác động của một số TAL effector và hoạt động như “gen mẫn cảm” (susceptibility gene) đối với Xoo [13, 20, 29, 66]. Đặc biệt, nghiên cứu hệ gen của một số giống lúa mang alen kháng bạc lá xa41(t) cho thấy các giống lúa này mang đột biến mất 18 bp trên promoter OsSWEET14 và có thể kháng hơn 50% các chủng vi khuẩn Xoo của châu Á và châu Phi (đã biết) [56]. Gần đây, Blanvillain–Baufumé và nhóm nghiên cứu (2017) đã sử dụng cơng nghệ chỉnh sửa hệ gen TALEN để tạo ra dòng lúa Kitaake đột biến gen OsSWEET14 (Kitaake–MU) thể hiện tính
kháng đối với chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh trước đó [13]. Trong nghiên cứu này, hai dịng lúa Kitaake–WT và Kitaake–MU đã được sử dụng để dự đốn vai trị của
OsSWEET14 đối với cơ chế gây bệnh của các chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại
miền Bắc Việt Nam.
Để thực hiện thí nghiệm này, 6 chủng Xoo đại diện cho 6 địa phương trồng lúa đã được lựa chọn ngẫu nhiên cho thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo, bao gồm: VXO_52 (Hà Nội), VXO_54 (Nam Định), VXO_59 (Bắc Giang), VXO_60 (Nghệ An), VXO_61 (Hải Phịng) và VXO_62 (Thái Bình). Kết quả lây nhiễm 6 chủng vi khuẩn Xoo đại diện trên 2 dịng lúa Kitaake–WT và Kitaake–MU (Hình 3.3) cho thấy cây lúa Kitaake–WT mẫn cảm với tất cả các chủng Xoo đại diện, chiều dài vết bệnh đo được từ 16 cm (VXO_60) đến 26 cm (VXO_62). Trong khi đó, Kitaake–MU thể hiện tính kháng đối với 5/6 chủng, thể hiện ở chiều dài các vết bệnh đều thấp hơn 8 cm. Duy nhất chủng VXO_60 gây ra độc tính mạnh trên cả 2 dịng lúa Kitaake–WT và Kitaake–MU, thể hiện ở chiều dài vết bệnh đo được lần lượt là 17 cm và 20 cm. Kết quả này cho phép dự đốn gen
OsSWEET14 có thể liên quan đến cơ chế xâm nhiễm gây bệnh bạc lá lúa của hầu
hết (5/6 chủng) vi khuẩn Xoo đại diện, bao gồm VXO_52, VXO_54, VXO_59,
Hình 3.3: Độc tính của các chủng vi khuẩn Xoo đại diện trên lúa Kitaake Ghi chú: Cây lúa Kitaake bình thường (WT) và mang đột biến gen OsSWEET14
(MU) được lây nhiễm với 6 chủng vi khuẩn Xoo đại diện (VXO_52, 54, 59, 60, 61 và
62) bằng phương pháp cắt lá. (A) Lá cây lúa sau 14 ngày lây nhiễm vi khuẩn; mũi tên thể hiện điểm kết thúc của vết bệnh. (B) Đồ thị so sánh chiều dài vết bệnh trên
các mẫu lá lúa sau 14 ngày lây nhiễm. Số liệu trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Ở Việt Nam, trong một số chương trình chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá, các dòng lúa chỉ thị (tester) mang QTL (quantitative trait locus) kháng bệnh bạc lá thường được sử dụng để xác định gen kháng tương ứng với các chủng Xoo quan tâm. Từ đó, thơng qua phương pháp lai tạo kết hợp với chọn lọc bằng chỉ thị phân tử, các QTL này được đưa vào giống lúa mục tiêu để tạo ra giống kháng bệnh. Mặt khác, nguồn gen kháng cũng được xác định/ khảo sát trên một số giống lúa tự nhiên có tính kháng bệnh bạc lá bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử có sẵn [4, 6]. Tuy nhiên, cho đến nay hầu như chưa có một nghiên cứu nào về cơ chế
phân tử của quá trình xâm nhiễm của các chủng vi khuẩn Xoo Việt Nam trên các giống lúa phổ biến, đặc biệt là mối liên quan với các gen vận chuyển đường được thực hiện. Nghiên cứu này lần đầu tiên đã chứng tỏ cơ chế gây bệnh bạc lá lúa của một số chủng vi khuẩn Xoo đại diện thu thập tại Việt Nam có thể liên quan tới hoạt động của gen OsSWEET14. Trong một nghiên cứu khác, nhóm nghiên cứu của
Tiến sĩ Cao Lệ Quyên (Viện Di truyền Nông nghiệp) cũng đã chứng minh gen
OsSWEET14 được hoạt hóa biểu hiện sau khi lây nhiễm nhân tạo bởi 3/5 chủng vi
khuẩn Xoo đại diện này (số liệu chưa được công bố). Các kết quả bước đầu này đã cho thấy tiềm năng to lớn của hướng nghiên cứu cải tạo khả năng kháng bệnh bạc lá phổ rộng cho giống lúa TBR225 thông qua việc chỉnh sửa gen OsSWEET14
bằng công nghệ CRISPR/Cas9.
3.2. NHÂN DỊNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ PROMOTER SW14–TBR
3.2.1. Nhân bản promoter SW14–TBR
Trong nhiều nghiên cứu về promoter đã được công bố, đoạn DNA quan tâm thường được phân lập và dịng hóa vào vector nhân dịng trước khi đưa vào vector biểu hiện nhằm phục vụ việc nghiên cứu chức năng [22, 48]. Streubel. J và nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập đoạn DNA dài 341 bp nằm trên promoter OsSWEET14 để nghiên cứu chức năng và vai trò của gen OsSWEET14 đối với cơ chế xâm nhiễm của Xoo trên giống lúa IRBB13 [66]. Trong nghiên cứu này, trình tự promoter đầy đủ và một phần mã hoá trên gen OsSWEET14 của giống lúa TBR225 (gọi tắt là SW14–TBR) được phân lập bằng PCR từ DNA tổng số của mẫu lá lúa non để phân
tích trình tự nucleotide nhằm dự đốn vai trị của gen OsSWEET14 đối với quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn Xoo trên lúa TBR225, đồng thời phục vụ nghiên cứu tạo giống lúa TBR225 kháng bệnh bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa promoter/gen sau này. Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi SW14–Fw/SW14–Rv được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide của OsSWEET14 đã được công bố trên Genbank.
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy sản phẩm PCR chỉ xuất hiện một băng DNA duy nhất có kích thước xấp xỉ 1,4 kb tương ứng với kích thước lý thuyết của đoạn promoter SW14–TBR (1392 bp) (Hình 3.4, giếng 2). Như vậy, đoạn promoter