Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn pGEM/SW14–TBR được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi SW14–
Fw/SW14–Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7–Pro/SP6–Pro; giếng 1 và 3: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2 và 4: khn là pGEM/SW14–TBR.
(B) Cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới hạn; giếng 1: sản phẩm cắt giới
hạn bằng EcoRI; giếng 2: sản phẩm cắt bằng NdeI; giếng 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng NdeI/BglII; giếng 4: vector pGEM/SW14–TBR nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
3.2.3. Giải trình tự promoter SW14–TBR
Để khẳng định chính xác đoạn DNA phân lập được là promoter SW14–TBR,
vector tái tổ hợp pGEM/SW14–TBR được giải trình tự nucleotide bằng hệ thống máy giải trình tự ABI3100 và phân tích bằng phần mềm BioEdit. Kết quả so sánh trình tự nucleotide cho thấy đoạn promoter SW14–TBR phân lập được có chiều dài 1392 bp (Phụ lục 3), giống 99% so với trình tự promoter OsSWEET14 của giống lúa
Niponbare (Japonica, mã số AP014967.1) và giống ~100% (1 vị trí sai khác) so với trình tự promoter OsSWEET14 của giống lúa Shuhui498 (Indica, mã số CP018167.1) đã được cơng bố trên GenBank (Hình 3.7).
Kết quả phân tích trình tự chi tiết hơn bằng phần mềm Benchling [89] cho thấy trình tự đoạn DNA phân lập được nằm từ vị trí (–1341) đến (+51) của OsSWEET14, bao gồm vùng promoter dài 1341 bp và một đoạn dài 51 bp mang tồn bộ trình tự mã hóa của Exon I. Đoạn promoter SW14–TBR phân lập được cũng chứa trình tự TA
Box đặc trưng cho vùng promoter ở vị trí (–259). Đặc biệt, trên promoter SW14–TBR có chứa 4 trình tự DNA (yếu tố điều hòa cis) liên kết đặc hiệu với protein TAL, được
gọi là EBE (effector–binding element), của một số chủng vi khuẩn Xoo đã được công bố [14], bao gồm TalC, Tal5, PthXo3 và AvrXa7 (Hình 3.8). EBE TalC và Tal5 đã được Yu xác định nằm trên promoter OsSWEET14 của lúa Niponbare [80], trong khi EBE PthXo3 và AvrXa7 được chứng minh là vị trí tương tác của protein TAL PthXo3 và AvrXa7 với gen OsSWEET14 của giống lúa Kitake, Niponbare và IR24 [77, 82]. Trong nghiên cứu này, promoter OsSWEET14 của lúa TBR225 đã được xác định có chứa cả 4 trình tự EBE nói trên. Tuy nhiên, vai trị chính xác của các EBE này đối với tính mẫn cảm của lúa TBR225 với các chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại miền Bắc Việt Nam sẽ cần được nghiên cứu thêm.