Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-
4.2.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học của chủng virus KTY- PRRS-06 bằng việc tiến hành cấy chuyển chủng virus đó liên tục qua 40 đời trên môi trường tế bào Marc-145. Sau mỗi đời cấy chuyển chúng tôi thu hoạch tế bào nhiễm virus và bảo quản trong các ống Eppendorf chuyên dùng giữ trong điều kiện lạnh sâu -860C. Do điều kiện thời gian nghiên cứu hạn chế, số lượng các đời tương đối nhiều nên chúng tôi sẽ lựa chọn đại diện các đời cấy chuyển: Đời 0, đời 10, đời 20, đời 30 và đời 40 để tiến hành nghiên cứu khả năng nhân lên của các thế hệ virus và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của chủng virus này.
Cụ thể chúng tôi chuẩn bị một khay 96 giếng tế bào Marc-145 đã mọc đều một lớp trên bề mặt nuôi cấy. Số lượng tế bào trong một giếng của khay được xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Sau đó, huyễn dịch chứa virus được đưa vào gây nhiễm cho các giếng tế bào theo lượng thích hợp để đảm bảo MOI = 0,01. Khay tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 37°C/5% CO2 để theo dõi CPE qua các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ… sau khi gây nhiễm cho đến khi CPE không còn phát triển thêm trên các giếng tế bào nữa.
Kết quả theo dõi sự nhân lên của virus nghiên cứu qua sự phát triển bệnh tích tế bào trên môi trường tế bào Marc-145 được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus
KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
Chủng virus Giờ Đời 1 Đời 10 CPE (%) Đời 20 Đời 30 Đời 40
KTY-PRRS-06 24h 15* 20 20 25 25 36h 40 45 45 55 55 48h 60 65 65 70 70 60h 85 90 90 90 90 72h 100 100 100 100 100 84h B B B B B Ghi chú:
*: % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy (ước lượng bằng mắt khi soi trên kính hiển vi soi nổi)
Trong quá trình theo dõi tiến triển bệnh tích tế bào (CPE) sau khi gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-06 ở các đời cấy chuyển chúng tôi thấy:
- Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus: Thảm tế bào phát triển bình thường, hình thái tế bào đặc trưng rõ nét (hình 4.1).
- Thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm: khoảng 15-25% lượng tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình.
- Sau 36 giờ gây nhiễm, chủng virus KTY-PRRS-06 phá hủy 40% lượng tế bào so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy khi chưa cấy chuyển ở đời thứ nhất; 45% lượng tế bào ở các đời cấy chuyển thứ 10, 20 và 55% ở đời cấy chuyển thứ 30, 40. Các tế bào bắt đầu co cụm lại với nhau. Kết quả được thể hiện cụ thể tại hình 4.2.
- Ở thời điểm 48 giờ sau khi gây nhiễm, số lượng tế bào bị phá hủy tăng lên 60% ở đời thứ nhất; 65% ở các đời cấy chuyển thứ 10, 20 và 70% ở đời cấy chuyển thứ 30, 40. Khi quan sát bằng kính hiển vi soi nổi thấy xuất hiện một số tế bào co tròn, tụ lại thành từng đám từ 5-7 tế bào, sáng nổi rõ trên nền tế bào. Kết quả được thể hiện tại hình 4.3.
- Thời điểm 60 giờ sau khi gây nhiễm thì virus gây bệnh tích tế bào, lượng tế bào Marc-145 bị phá hủy ở mức khá cao từ 85% ở đời thứ nhất và 90% ở các đời cấy chuyển thứ 10, 20, 30, 40 (hình 4.4).
- Đến thời điểm 72 giờ sau nhiễm: Lượng tế bào Marc-145 bị phá hủy 100% ở tất cả các đời chủng virus KTY-PRRS-06 nghiên cứu. Các tế bào bị phá hủy hoàn toàn, bắt đầu bong tróc khỏi đáy bình, có thể quan sát rất rõ hình thái bệnh tích này qua kính hiển vi soi nổi (hình 4.5).
- Sau 84 giờ gây nhiễm: Toàn bộ tế bào bị phá hủy và bong tróc khỏi bề mặt bình nuôi cấy.
Qua kết quả tại bảng 4.5 cho thấy virus PRRS xâm nhập vào tế bào và nhân lên nhanh chóng, gây ra bệnh tích tế bào rất điển hình; không có sự sai khác nhiều về khả năng nhân lên và phá hủy tế bào ở những thời điểm nhất định giữa các đời cấy chuyển. Như vậy, khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus ở các đời cấy chuyển ổn định.
Một số hình ảnh bệnh tích tế bào khi gây nhiễm virus KTY-PRRS-06
Hình 4.1. Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus
Hình 4.2. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Hình 4.3. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Kết quả nghiên cứu về tốc độ nhân lên và gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY-PRRS-06 trong nghiên cứu của chúng tôi có phần cao hơn so với với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Trang (2015) về virus nhược độc PRRS Hanvet1.VN trên tế bào Marc-145 và kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan (2011) về các chủng PRRS phân lập được tại các vùng phụ cận Hà Nội. Theo chúng tôi nguyên nhân là do chủng virs KTY-PRRS-06 có độc lực cao hơn so với các chủng virus trong nghiên cứu của các tác giả nói trên.
Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Toan và cs. (2016) nghiên cứu về đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS- 06 phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển.
Như vậy, chúng tôi đánh giá sơ bộ về mức độ nhân lên của virus PRRS cũng như sức sống của virus KTY-PRRS-06 được lựa chọn để nghiên cứu, cơ bản chủng virus sau khi gây nhiễm đều có khả năng nhân lên mạnh mẽ, gây ra bệnh tích tế bào và hủy hoại tế bào nhanh chóng, ổn định.
Bên cạnh đó, chúng tôi nhận thấy phương thức bảo quản virus KTY-PRRS- 06 trong nghiên cứu này là khá tốt, đảm bảo được yêu cầu đặt ra. Vì vậy, các chủng virus này có thể tiếp tục dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.