3.3.1 .Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
3.3.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
RNA tổng số là toàn bộ RNA được tách chiết từ mẫu nghiên cứu. Muốn thu RNA thì cần loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả RT- PCR. RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt động (tRNA, mRNA) của tế bào và virus. Mục đích là thu nhận được RNA của hệ gen virus PRRS đạt hàm lượng cao, đảm bảo đủ làm khuôn cho RT- PCR.
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit. Bước 1: Hút 560µl Buffer AVL vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
Bước 2: Thêm 140µl dung dịch mẫu đã xử lý là hỗn dịch (chứa virus và dung dịch PCS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó vortex trong 15 giây.
Bước 3: Spin down
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 5: Thêm 560 µl dung dịch Ethanol (96% - 100%) vào ống, vortex 15 giây và Spin down để loại bỏ các giọt trên nắp.
Bước 6: Hút 630µl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin (cột lọc). Ly tâm 8.000 vòng/phút, trong 2 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới ống.
Bước 7: Lặp lại bước 6 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 8: Thêm 500µl dung dịch AW1, ly tâm 8.000 vòng/phút, trong 2 phút rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
Bước 9: Thêm 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14.000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới cột. Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 14.000vòng/phút,trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn AW2.
Bước 10: Đặt cột QIA vào ống Eppendorf 1,5ml mới sau đó thêm 60ml dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Sau đó ly tâm 8.000 vòng, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -80°C.