PED và TGE
Virus PRRSV CSFV FMDV PEDV TGEV
Kết quả + - - - -
Ghi chú: +: là dương tính; -: là âm tính
Kết quả bảng 4.4 cho thấy trong huyễn dịch tế bào virus PRRS chúng tôi lựa chọn nghiên cứu chỉ phát hiện sự có mặt của virus PRRS. Các virus còn lại đều cho kết quả âm tính (không phát hiện thấy sự có mặt của chúng trong huyễn dịch tế bào).
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-06 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-06
4.2.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học của chủng virus KTY- PRRS-06 bằng việc tiến hành cấy chuyển chủng virus đó liên tục qua 40 đời trên môi trường tế bào Marc-145. Sau mỗi đời cấy chuyển chúng tôi thu hoạch tế bào nhiễm virus và bảo quản trong các ống Eppendorf chuyên dùng giữ trong điều kiện lạnh sâu -860C. Do điều kiện thời gian nghiên cứu hạn chế, số lượng các đời tương đối nhiều nên chúng tôi sẽ lựa chọn đại diện các đời cấy chuyển: Đời 0, đời 10, đời 20, đời 30 và đời 40 để tiến hành nghiên cứu khả năng nhân lên của các thế hệ virus và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của chủng virus này.
Cụ thể chúng tôi chuẩn bị một khay 96 giếng tế bào Marc-145 đã mọc đều một lớp trên bề mặt nuôi cấy. Số lượng tế bào trong một giếng của khay được xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Sau đó, huyễn dịch chứa virus được đưa vào gây nhiễm cho các giếng tế bào theo lượng thích hợp để đảm bảo MOI = 0,01. Khay tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 37°C/5% CO2 để theo dõi CPE qua các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ… sau khi gây nhiễm cho đến khi CPE không còn phát triển thêm trên các giếng tế bào nữa.
Kết quả theo dõi sự nhân lên của virus nghiên cứu qua sự phát triển bệnh tích tế bào trên môi trường tế bào Marc-145 được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus
KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
Chủng virus Giờ Đời 1 Đời 10 CPE (%) Đời 20 Đời 30 Đời 40
KTY-PRRS-06 24h 15* 20 20 25 25 36h 40 45 45 55 55 48h 60 65 65 70 70 60h 85 90 90 90 90 72h 100 100 100 100 100 84h B B B B B Ghi chú:
*: % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy (ước lượng bằng mắt khi soi trên kính hiển vi soi nổi)
Trong quá trình theo dõi tiến triển bệnh tích tế bào (CPE) sau khi gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-06 ở các đời cấy chuyển chúng tôi thấy:
- Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus: Thảm tế bào phát triển bình thường, hình thái tế bào đặc trưng rõ nét (hình 4.1).
- Thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm: khoảng 15-25% lượng tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình.
- Sau 36 giờ gây nhiễm, chủng virus KTY-PRRS-06 phá hủy 40% lượng tế bào so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy khi chưa cấy chuyển ở đời thứ nhất; 45% lượng tế bào ở các đời cấy chuyển thứ 10, 20 và 55% ở đời cấy chuyển thứ 30, 40. Các tế bào bắt đầu co cụm lại với nhau. Kết quả được thể hiện cụ thể tại hình 4.2.
- Ở thời điểm 48 giờ sau khi gây nhiễm, số lượng tế bào bị phá hủy tăng lên 60% ở đời thứ nhất; 65% ở các đời cấy chuyển thứ 10, 20 và 70% ở đời cấy chuyển thứ 30, 40. Khi quan sát bằng kính hiển vi soi nổi thấy xuất hiện một số tế bào co tròn, tụ lại thành từng đám từ 5-7 tế bào, sáng nổi rõ trên nền tế bào. Kết quả được thể hiện tại hình 4.3.
- Thời điểm 60 giờ sau khi gây nhiễm thì virus gây bệnh tích tế bào, lượng tế bào Marc-145 bị phá hủy ở mức khá cao từ 85% ở đời thứ nhất và 90% ở các đời cấy chuyển thứ 10, 20, 30, 40 (hình 4.4).
- Đến thời điểm 72 giờ sau nhiễm: Lượng tế bào Marc-145 bị phá hủy 100% ở tất cả các đời chủng virus KTY-PRRS-06 nghiên cứu. Các tế bào bị phá hủy hoàn toàn, bắt đầu bong tróc khỏi đáy bình, có thể quan sát rất rõ hình thái bệnh tích này qua kính hiển vi soi nổi (hình 4.5).
- Sau 84 giờ gây nhiễm: Toàn bộ tế bào bị phá hủy và bong tróc khỏi bề mặt bình nuôi cấy.
Qua kết quả tại bảng 4.5 cho thấy virus PRRS xâm nhập vào tế bào và nhân lên nhanh chóng, gây ra bệnh tích tế bào rất điển hình; không có sự sai khác nhiều về khả năng nhân lên và phá hủy tế bào ở những thời điểm nhất định giữa các đời cấy chuyển. Như vậy, khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus ở các đời cấy chuyển ổn định.
Một số hình ảnh bệnh tích tế bào khi gây nhiễm virus KTY-PRRS-06
Hình 4.1. Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus
Hình 4.2. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Hình 4.3. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm gây nhiễm
Kết quả nghiên cứu về tốc độ nhân lên và gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY-PRRS-06 trong nghiên cứu của chúng tôi có phần cao hơn so với với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Trang (2015) về virus nhược độc PRRS Hanvet1.VN trên tế bào Marc-145 và kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan (2011) về các chủng PRRS phân lập được tại các vùng phụ cận Hà Nội. Theo chúng tôi nguyên nhân là do chủng virs KTY-PRRS-06 có độc lực cao hơn so với các chủng virus trong nghiên cứu của các tác giả nói trên.
Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Toan và cs. (2016) nghiên cứu về đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS- 06 phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển.
Như vậy, chúng tôi đánh giá sơ bộ về mức độ nhân lên của virus PRRS cũng như sức sống của virus KTY-PRRS-06 được lựa chọn để nghiên cứu, cơ bản chủng virus sau khi gây nhiễm đều có khả năng nhân lên mạnh mẽ, gây ra bệnh tích tế bào và hủy hoại tế bào nhanh chóng, ổn định.
Bên cạnh đó, chúng tôi nhận thấy phương thức bảo quản virus KTY-PRRS- 06 trong nghiên cứu này là khá tốt, đảm bảo được yêu cầu đặt ra. Vì vậy, các chủng virus này có thể tiếp tục dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.
4.2.2. Kết quả xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06
Sau khi lựa chọn được chủng virus PRRS dùng để nghiên cứu (bảng 4.3), chúng tôi tiến hành tìm hiểu đặc tính sinh học của chúng qua việc xác định hiệu giá virus.
Chúng tôi chuẩn bị một khay 96 giếng đã phủ tế bào Marc-145 một lớp. Số lượng tế bào trong một giếng của khay được xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Huyễn dịch virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau một giờ ủ, chúng tôi bổ sung vào mỗi giếng 100µl dung dịch duy trì DMEM có chứa 10% TBP. Sau đó để khay tế bào đã gây nhiễm virus trong tủ ấm 37°C/5% CO2.
Quan sát CPE qua các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ,….sau gây nhiễm. Sau đó, virus được thu hoạch và xác định TCID50 theo phương pháp của Reed-Muench.
* Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của virus trên tế bào
giờ, 120 giờ sau gây nhiễm tiến hành thu hoạch virus chủng KTY-PRRS-06 đời P0. Dịch virus thu được tại mỗi thời điểm được trộn chung thành một mẫu đồng nhất để xác định hiệu giá. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để có đánh giá trung bình. Kết quả được trình bày tại bảng 4.6.
Bảng 4.6. Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 tại các thời điểm thu hoạch
Thời điểm thu virus (giờ) 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Hiệu giá virus L1 102,5 102,5 103,7 104,5 104,7 102,6 102,3 101,8 101,5 L2 102,2 102,8 103,3 104,4 104,38 102,64 102,5 102,0 101,8 L3 101,99 102,5 103,3 104,2 104,6 102,5 102,2 101,7 101,6 TB 102,23 102,6 103,43 104,37 104,56 102,58 102,33 101,83 101,63
Hình 4.6. Đường cong sinh trưởng của virus KTY – PRRS - 06
Qua bảng số liệu tại bảng 4.6 và đồ thị sinh trưởng, phát triển của virus PRRS chủng KTY-PRRS-06 cho thấy:
Sau gây nhiễm 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trưởng, giá trị Log10TCID50/25µl trung bình đạt 2,23, hàm lượng virus phát triển tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt cao nhất vào 72 giờ sau gây nhiễm, vào thời điểm này giá trị Log10TCID50/25µl trung bình đạt 4,56.
Sau thời điểm 72 giờ, hiệu giá virus giảm nhanh chóng. Đến thời điểm 120 giờ sau gây nhiễm hiệu giá vi rút chỉ còn 101,63 TCID50/25µl.
Từ đó chúng tôi rút ra kết luận thời điểm thu hoạch virus tốt nhất là 72 giờ sau khi gây nhiễm tế bào. Tại thời điểm này hàm lượng virus đạt cao nhất và hiệu giá virus ổn định nhất. Theo chúng tôi sở dĩ có sự suy giảm hàm lượng virus sau 72 giờ sau gây nhiễm nguyên nhân chủ yếu là do số lượng tế bào Marc-145 do virus PRRS phá hủy.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145 tương tự với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Trang (2015) về chủng virus PRRS nhược độc Hanvet1.Vn. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Nguyễn Thu Trang, tác giả cho biết khoảng thời gian virus Hanvet1.Vn sinh trưởng và phát triển mạnh nhất là 80 - 96 giờ sau gây nhiễm.
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Toan và cs. (2016) nghiên cứu về đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-05 phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển.
Theo công bố của Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) lượng virus PRRS trong tế bào lên tục tăng mạnh sau 48 giờ sau gây nhiễm và đạt mức độ cao nhất ở 72 giờ sau khi gây nhiễm, với giá trị Log10 TCID50/25µl là 4,83 đời thứ nhất. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp với nghiên cứu của các tác giả nói trên.
* Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
Kết quả về hiệu giá trung bình của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển được trình bày ở bảng 4.7 và hình 4.7
Bảng 4.7. Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
Chủng virus Đời Hiệu giá virus TCID50/25µl
KTY-PRRS-06 P0 102,66 P10 102,87 P20 102,87 P30 103,16 P40 103,16
2.66 2.87 2.87 3.16 3.16 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3 3.1 3.2 P0 P10 P20 P30 P40
Log10 hiệu giá virus Đời cấy chuyển
Hình 4.7. Log10 hiệu giá của chủng virus KTY - PRRS – 06
qua các đời cấy chuyển
Qua bảng 4.7 và hình 4.7 cho thấy, hiệu giá virus trung bình thấp nhất được xác định khi chưa cấy chuyển có giá trị 102,66 TCID50/25µl; sau đó đến đời 10, đời 20 có giá trị là 102,87 và hiệu giá virus cao nhất được xác định là đời 30 và đời 40 với giá trị là 103,16. Sự chênh lệch về hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển là không đáng kể. Như vậy, chủng virus KTY-PRRS-06 có hiệu giá cao, ổn định qua các đời cấy chuyển thể hiện qua sự chệnh lệch giá trị giữa các đời không đáng kể.
Theo Nguyễn Thu Trang (2015) hiệu giá virus nhược độc Hanvet1.Vn qua các đời cấy chuyển từ P1-P10 dao động từ 106,37TCID50/ml - 106,63TCID50/ml. Theo chúng tôi có sự sai khác so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi đưa ra là do chủng virus nhược độc Hanvet1.Vn có độc lực thấp hơn so với chủng virus KTY-PRRS-06. Tuy nhiên, so sánh với kết quả nghiên cứu của Lê Thị Toan và cs. (2016) nghiên cứu về đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-05 phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển thì kết quả chúng tôi đưa ra là hoàn toàn phù hợp.
4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-06
Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử trên cơ cở phân tích về trình tự nucleotide và axit amin cũng như phân tích về cây phả hệ dựa trên trình tự đoạn
gen ORF5 là cơ sở quan trọng nhằm đánh giá sự biến đổi di truyền của các chủng virus KTY-PRRS-06 đang lưu hành ngoài thực địa, từ đó đánh giá sự biến chủng của virus theo thời gian.
4.3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY-PRRS-06
Chủng virus KTY-PRRS-06 sau khi phân lập được bảo quản trong điều kiện thích hợp (âm 800C). Ở nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển P0, P10, P20, P30, P40.
Chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu được nhân lên trên môi trường tế bào Marc-145 và sẽ được tiến hành tách chiết RNA tổng số theo quy trình tách chiết của bộ Kit QIAgen (đã trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu). Kết quả tách chiết RNA tổng số của virus sẽ được kiểm tra bằng điện di trên thạch Agarose 1,2% và là nguyên liệu cho phản ứng RT- PCR để tạo ra phân tử DNA hoàn chỉnh từ sợi đơn dương RNA. Kết quả kiểm tra tách chiết RNA tổng số được minh họa ở hình 4.8.
.
Hình 4.8. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số
(Theo thứ tự từ trái sang phải là kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng KTY-PRRS-06 ở các đời P0, P10, P20, P30, P40).
Qua hình ảnh điện di cho thấy có một lượng lớn RNA thu được sau khi tiến hành tách chiết, biểu hiện bằng các vệt sáng thu được khi chụp ảnh bằng máy chụp ảnh gel do RNA đã giữ Ethidiumbromide lại trên bản thạch và dưới tác dụng của tia UV các thuốc nhuộm này phát màu sáng. Đồng thời các RNA
tách chiết có độ nguyên vẹn cao biểu thị bằng một vạch sáng, do RNA tích điện âm nên trong điện trường chúng sẽ chạy về cực dương.
Nếu phổ điện di của RNA tách chiết khi hiện hình cho nhiều dải băng (nhiều vạch sáng) thì chứng tỏ khi chiết tách chúng đã bị gãy đoạn nhiều. Phổ điện di gọn chứng tỏ RNA chiết tách ít bị đứt gãy.
Như vậy, quá trình tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY-PRRS- 06 qua các đời cấy chuyển là thành công, cung cấp nguyên liệu cho phản ứng RT- PCR.
4.3.2. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06
* Kết quả phản ứng RT- PCR
Sản phẩm RNA tổng số của các chủng virus KTY-PRRS-06 thu được khi tách chiết sẽ được khuếch đại bằng kỹ thuật RT- PCR với sự tham gia của enzyme sao chép ngược (Reverse Transcriptase) và sử dụng cặp mồi ORF5 (đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu) có khả năng phát hiện virus PRRS thuộc cả chủng Bắc Mỹ và chủng Châu Âu (cặp mồi này cho phép xác định đoạn gen của virus PRRS có kích thước 683bp) để tạo ra các đoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA). Sản phẩm cDNA sau khi khuếch đại trong máy PCR sẽ được điện di và chụp ảnh.
Kết quả của phản ứng RT- PCR xác định PRRSV được trình bày ở hình 4.9.