3.3.1 .Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
3.3.6. Phương pháp giải trình tự Gen
Quá trình thực hiện giải trình tự gen bao gồm các bước sau:
* Tinh sạch sản phẩm RT- PCR
Sau phản ứng RT- PCR, một lượng lớn phân tử DNA của vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên. Sản phẩm tinh sạch được dùng để giải trình tự trực tiếp nên cần phải tiến hành tinh sạch sản phẩm sau phản ứng RT- PCR để loại bỏ tạp chất (1 lượng primer, dNTP dư và enzyme DNA polymerase).
Chúng tôi tinh sạch sản phẩm RT- PCR sử dụng bộ hóa chất của hãng Bioneer, tiến hành theo hướng dẫn sau:
Bước 1: Cho vào ống Eppendorf sản phẩm RT- PCR vào dung dịch PB theo tỷ lệ 1: 5 sau đó trộn đều.
Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch sang cột lọc và li tâm 13.000 vòng/phút, trong 1 phút ở 280C. Rồi bỏ dịch ở đáy ống giữ cột.
Bước 3: Thêm 500µl WB lên cột. Li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ nước giữ cột. Sau đó li tâm thêm một lần nữa 13.000 vòng/phút, trong 1 phút.
dung dịch EL, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó li tâm 11.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lấy nước dưới. Dịch bên dưới chính là sản phẩm RT- PCR đã được tinh sạch. Ký hiệu mẫu và bảo quản -200C.
* Thực hiện phản ứng PCR sequencing
Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml bao gồm: DTCS Qucick start master Mix, DN, Primer, DH2O. Sau đó, tinh sạch sản phẩm PCR sequence để giải trình tự.
* Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR-sequencing
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter –Mỹ).
Các bước tinh sạch sản phẩm như sau:
Bước 1: Sản phẩm của phản ứng PCR- sequence sẽ được bổ sung 2µl Sodium acetate, 2µl EDTA Na2 và 1µl glycogen
Bước 2: Bổ sung thêm 60µl cồn 1000 trong điều kiện lạnh và tiến hành ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, sau đó loại bỏ dịch nổi trên ống và giữ lại cặn DNA.
Bước 3: Bổ sung 200µl cồn 750, tiến hành ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.
Bước 4: Lặp lại bước 3 một lần nữa và để DNA khô tự nhiên hoặc đặt trong máy quay khô chân không
Bước 5: Bổ sung 40µl SLS vào mỗi mẫu và trộn đều.
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự gen.