Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3.2. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06
* Kết quả phản ứng RT- PCR
Sản phẩm RNA tổng số của các chủng virus KTY-PRRS-06 thu được khi tách chiết sẽ được khuếch đại bằng kỹ thuật RT- PCR với sự tham gia của enzyme sao chép ngược (Reverse Transcriptase) và sử dụng cặp mồi ORF5 (đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu) có khả năng phát hiện virus PRRS thuộc cả chủng Bắc Mỹ và chủng Châu Âu (cặp mồi này cho phép xác định đoạn gen của virus PRRS có kích thước 683bp) để tạo ra các đoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA). Sản phẩm cDNA sau khi khuếch đại trong máy PCR sẽ được điện di và chụp ảnh.
Kết quả của phản ứng RT- PCR xác định PRRSV được trình bày ở hình 4.9.
Hình 4.9. Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5
[Virus KTY-PRRS-06 được phát hiện bằng phản ứng RT-PCR với độ dài của gen là 683bp, thang
chẩn M 100bp, giếng từ 1-5 là mẫu của các đời virus KTY - PRRS – 06 (lần lượt từ phải qua trái là P0, P10, P20, P30, P40), giếng 6 là đối chứng âm, giếng 7 là đối chứng dương (virus PRRS)].
Sản phẩm điện di cho vạch DNA tương ứng với 683bp đúng theo thiết kế mồi. Kết quả tạo DNA của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển là thành công. Như vậy chúng tôi đã khẳng định được chính xác sự có mặt của virus PRRS trong các mẫu được nuôi cấy chuyển đời trên môi trường tế bào Marc -145
Kết quả giải trình tự gen ở các đời cấy chuyển.
Sau khi tiến hành kỹ thuật RT- PCR và thu được sản phẩm chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT- PCR bằng Kit để loại bỏ hết các thành phần dư thừa sau phản ứng. Sản phẩm sau khi tinh sạch là DNA của virus sẽ được cloning với từng loại mồi đơn (mồi xuôi và mồi ngược) để nhân nhanh số lượng bản sao theo một chiều của đoạn gene.
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự bằng Kit được cung cấp của nhà sản xuất, sau đó tiến hành giải trình tự gene. Quá trình giải trình tự được thực hiện nhờ vào máy giải trình tự Beckman coulter CEQ 8000 của Mỹ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú Y - Khoa Thú Y. Kết quả được biểu thị bằng chương trình Geneetyx và được trình bày minh họa ở hình 4.10.
Qua hình 4.10 cho thấy chất lượng giải trình tự tương đối tốt, mỗi đỉnh màu của giản đồ đều thể hiện một loại nucleotide, các loại nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong đó Adenine cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen. Sau khi giải trình tự, chuỗi nucleotide thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm phân tích trên máy tính.Sau khi phân tích chúng tôi thu được toàn bộ đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-06 có độ dài 603bp.
Như vậy việc tách chiết RNA tổng số, quá trình thực hiện RT- PCR và giải trình tự đã được thực hiện thành công. Trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng qua các đời nghiên cứu đã được các định.
Hình 4.10. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạngen ORF5 của chủng KTY-PRRS-06 ở đời cấy chuyển thứ 10