2.3.8.1. Phòng bệnh
- Phòng bệnh bằng vệ sinh:
Khi chưa có dịch, tăng cường chăm sóc, dinh dưỡng, vệ sinh chuồng trại để phát hiện sớm, tiêm phòng các loại vacxin đầy đủ. Nhập lợn từ cơ sở chăn nuôi sạch bệnh, lợn mới mua thì nuôi cách ly 3-4 tuần lễ, kiểm dịch chặt chẽ.
Khi có dịch thì phải công bố dịch. Cơ sở chăn nuôi phải thống kê số lợn ốm, lợn chết, báo cáo cho chính quyền và thú y địa phương để xử lý theo hướng dẫn phòng chống bệnh tai xanh của Cục thú y.
- Phòng bệnh bằng vacxin:
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chế phẩm vacxin được dùng để phòng bệnh PRRS như:
* Vacxin BSL-PS100
Vacxin PRRS nhược độc đông khô thế hệ mới có nguồn gốc từ chủng JKL- 100 thuộc họ Châu Mỹ, một liều chứa ít nhất 105TCID50/1ml. Có độ an toàn rất cao, vacxin an toàn dù chủng cao gấp 20 liều.
* Vacxin BSK-PS100
Vacxin vô hoạt chứa chủng PRRSV dòng Châu Âu. Một liều vacxin chứa ít nhất 107,5TCID50/1ml. Vacxin có độ an toàn rất cao, thử nghiệm đã chứng minh BSK-PS100 an toàn dù chủng cao gấp 10 liều, vacxin an toàn đối với vật mang thai.
* Vacxin Amervac-PRRS (nhà sản xuất Laboratorias HIPRA, Si–Tây Ban Nha)
Vacxin nhược độc dạng đông khô, chứa PRRSV chủng Châu Âu VP046BIS, mỗi liều chứa ít nhất 103,5TCID50/1ml.
* Vacxin Solvente/A3 (Blanco), Solvent/A3 (White), lọ 20ml.
Tiêm bắp cổ sâu, liều 2ml/con.
* Vacxin Porcillis PRRS của Hà Lan.
2.3.8.2. Trị bệnh
Hiện nay chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại của bệnh chủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa các triệu chứng lâm sàng, giảm nhẹ và tập trung vào điều trị các bệnh kế phát.
- Đối với lợn nái trong giai đoạn chửa kỳ cuối, dùng Antiprostaglandin, Acetylsalicylic để làm giảm sốt và kéo dài việc mang thai khi ở giai đoạn đầu của ổ dịch (Tô Long Thành).
- Có thể dùng Clotetracylin bổ sung vào trong thức ăn để phòng vi khuẩn kế phát (Tô Long Thành).
- Giai đoạn lợn ăn ít cần bổ sung các thức ăn có năng lượng cao. - Đảm bảo đủ sữa cho lợn con bú.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng virus KTY-PRRS-06 được phân lập tại ổ dịch ở Hải Phòng năm 2015 và lưu trữ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
* Mẫu virus nghiên cứu
Chủng virus KTY-PRRS-06 đã được phân lập được từ mẫu bệnh phẩm của lợn mắc PRRS được bảo quản ở phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
* Dụng cụ, máy móc, thiết bị
- Chai nuôi cấy tế bào, khay 24 giếng, khay 96 giếng, pipet.
- Tủ ấm 370C/ 5% CO2, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh các loại: -40C, -200C, -800C, bình nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh tế bào...
- Sử dụng buồng cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy PCR,...
- Máy giải trình tự tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ), máy tính và các phần mềm xử lý dữ liệu như phần mềm CEQ 8000 (version 9.0), phần mềm Genetyx (version 5.0.4), MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10).
* Hóa chất, môi trường
- Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong bình nuôi (T25 hoặc T75) và trên khay 24 giếng.
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM, FCS, kháng sinh (Penicillin (100 U/µl), Streptomycin (100 µg/ml), EDTA, Trypsin, DMSO),…
- Các chất dùng để tách chiết RNA của virus: Trizol (1ml Trizol/2ml hỗn dịch), PCS, Chloroform, Iso-propy alcohol, Ethanol 70%.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Bộ môn Bệnh lý Thú y - Khoa Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam. - Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y - Khoa Thú Y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.4. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Hồ sơ giống virus KTY-PRRS-06 lựa chọn nghiên cứu. - Khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. - Hiệu giá virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
3.2.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Giải trình tự gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06;
- So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
- So sánh trình tự axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của chủng virus KTY-PRRS-06.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1.Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
* Chuẩn bị tế bào Marc-145
- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
bào và bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS. Đóng chặt bình nuôi cấy lại, ghi tên tế bào và ngày gọi dậy lên nắp bình nuôi cấy.
Bước 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
- Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA. Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ Trypsin, đem ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
* Gây nhiễm virus KTY-PRRS-06
Khi tế bào một lớp Marc-145 (tế bào phủ kín thành một lớp trên bề mặt nuôi cấy, không chồng chéo lên nhau) trong giếng đã chuẩn bị cho việc tiến hành gây nhiễm mọc kín hầu hết mặt giếng nuôi thì hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100µl mẫu đã chuẩn bị. Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 370C với 5% CO2.
Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi vào các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ sau khi gây nhiễm.
* Thu virus
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi, chụp ảnh tế bào, thu virus khi chúng phá hủy 80% - 90% tế bào gây nhiễm.
- Chủng virus được bảo quản trong tủ -80°C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50
Tế bào Marc-145 một lớp được chuẩn bị trên khay 96 giếng. Mỗi giếng chứa 2,0x104 tế bào, dịch môi trường được hút bỏ. Huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm bỏ cặn, lấy phần nước trong pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 5% FBS được bổ sung vào các giếng tế bào đã gây nhiễm virus (100 µl/giếng).
Bệnh tích tế bào (CPE-Cyto Pathogenic Effect) được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định theo phương pháp Behrens-Karber (Lan NT et al., 2005).
3.3.3. Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển chuyển
Virus PRRS được gây nhiễm lên tế bào với tỷ lệ Multiplicity Of Infection - MOI là 0,01. Sau 1 giờ ủ, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch với 0,5ml PBS, sau đó bổ sung môi trường DMEM có chứa 10% TPB. Virus giải phóng ngoài tế bào và trong tế bào được thu riêng ở các thời điểm khác nhau sau khi gây nhiễm virus (ở 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ và 108 giờ). Đường cong nhân lên của virus được xây dựng có biến là Log10 của TCID50/25µl tại mỗi thời điểm thu virus.
3.3.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
RNA tổng số là toàn bộ RNA được tách chiết từ mẫu nghiên cứu. Muốn thu RNA thì cần loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả RT- PCR. RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt động (tRNA, mRNA) của tế bào và virus. Mục đích là thu nhận được RNA của hệ gen virus PRRS đạt hàm lượng cao, đảm bảo đủ làm khuôn cho RT- PCR.
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit. Bước 1: Hút 560µl Buffer AVL vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
Bước 2: Thêm 140µl dung dịch mẫu đã xử lý là hỗn dịch (chứa virus và dung dịch PCS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó vortex trong 15 giây.
Bước 3: Spin down
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 5: Thêm 560 µl dung dịch Ethanol (96% - 100%) vào ống, vortex 15 giây và Spin down để loại bỏ các giọt trên nắp.
Bước 6: Hút 630µl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin (cột lọc). Ly tâm 8.000 vòng/phút, trong 2 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới ống.
Bước 7: Lặp lại bước 6 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 8: Thêm 500µl dung dịch AW1, ly tâm 8.000 vòng/phút, trong 2 phút rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
Bước 9: Thêm 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14.000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới cột. Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 14.000vòng/phút,trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn AW2.
Bước 10: Đặt cột QIA vào ống Eppendorf 1,5ml mới sau đó thêm 60ml dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Sau đó ly tâm 8.000 vòng, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -80°C.
3.3.5. Phương pháp RT- PCR
* Các bước tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT- PCR theo bộ Kit one-step Invitrogen với các thành phần được trình bày dưới bảng 3.1
Bảng 3.1. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT- PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy(µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer Forwad 0,5 Primer reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Các cặp mồi dùng cho phản ứng RT- PCR bao gồm có mồi xuôi và mồi ngược nhằm khuếch đại đoạn gen ORF5 có kích thước 603bp của PRRSV, được trình bày dưới bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR
Trình tự nucleotid của đoạn mồi Kích thước
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
603 bp
Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 2 Duỗi mạch 95 15 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
* Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
Kỹ thuật điện di được sử dụng trong phân tích định tính, định lượng, thu nhận, tách các acid nucleic và protein từ một hỗn hợp mẫu.
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Người ta thường sử dụng 2 loại thạch để điện di là Agarose và Polyacrylamid. Hai loại thạch này được hòa tan trong dung dịch đệm là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này sử dụng thạch Agarose và dung dịch đệm TAE để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TAE 1 x hòa tan với 1,5 gram Agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, đợi tới khi thạch nguội (khoảng 500C-600C) cho thêm 3µl Ethidium Bromide rồi đổ vào khuôn có các
lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng kiểm tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 3-5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V, cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di bản gel được lấy ra nhuộm Ethydium bromide hoặc SYBR green trong khoảng từ 5-7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng các vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.3.6. Phương pháp giải trình tự Gen
Quá trình thực hiện giải trình tự gen bao gồm các bước sau:
* Tinh sạch sản phẩm RT- PCR
Sau phản ứng RT- PCR, một lượng lớn phân tử DNA của vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên. Sản phẩm tinh sạch được dùng để giải trình tự trực tiếp nên cần phải tiến hành tinh sạch sản phẩm sau phản ứng RT- PCR để loại bỏ tạp chất (1 lượng primer, dNTP dư và enzyme DNA polymerase).
Chúng tôi tinh sạch sản phẩm RT- PCR sử dụng bộ hóa chất của hãng Bioneer, tiến hành theo hướng dẫn sau:
Bước 1: Cho vào ống Eppendorf sản phẩm RT- PCR vào dung dịch PB theo tỷ lệ 1: 5 sau đó trộn đều.
Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch sang cột lọc và li tâm 13.000 vòng/phút, trong 1 phút ở 280C. Rồi bỏ dịch ở đáy ống giữ cột.
Bước 3: Thêm 500µl WB lên cột. Li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ nước giữ cột. Sau đó li tâm thêm một lần nữa 13.000 vòng/phút, trong 1 phút.