3.2.2. Hóa chất
Các thành phần khoáng đa lượng (N, P, K, Ca, Mg, S), khoáng vi lượng (Fe, Cu, Mn, Mo, B, I, Co, Zn), vitamin, các nguồn carbohydrate (sucrose) dùng để pha chế môi trường nuôi cấy được mua từ hãng hóa chất Sigma (Mỹ). Ngoài môi trường nuôi cấy cơ bản có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA (acid acetic naphthalene), cytokinin (BA: benzyl adenine) và gibberellin (GA3) và than hoạt tính. Môi trường chính được sử dụng trong nghiên cứu là Schenk and Hildebrandt (SH) và Murashige and Skoog.
Bảng 3.1. Thành phần môi trường MS Thành phần vi lượng mg/l µM Thành phần vi lượng mg/l µM CoCl2.6H2O 0,025 0,11 CuSO4.5H2O 0,025 0,1 FeNaEDTA 36,7 100 H3BO3 6,2 100,27 KI 0,83 5 MnSO4.H2O 16,9 100 Na2MoO4.2H2O 0.25 1,03 ZnSO4.7H2O 8,6 29,91 Thành phần đa lượng mg/l mM CaCl2 332,02 2,99 KH2PO4 170 1,25 KNO3 1900 18,79 MgSO4 180,54 1,5 NH4NO3 1650 20,61 Vitamins mg/l µM Glycine 2 26.64 myo-Inositol 100 554,94 Nicotinic acid 0,5 4,06 Pyridoxine HCl 0,5 2,43 Thiamine HCl 0,1 0,3
Bảng 3.2. Thành phần môi trường SH Thành phần vi lượng mg/l Thành phần vi lượng mg/l CoCl2.6H2O 0,1 CuSO4.5H2O 0,2 FeNaEDTA 19,8 H3BO3 5 KI 1 MnSO4.H2O 10 Na2MoO4.2H2O 0,1 ZnSO4.7H2O 1 Thành phần đa lượng mg/l CaCl2 151 KNO3 2500 MgSO4 195,05 (NH4)H2PO4 300 Vitamins mg/l myo-Inositol 1000 Nicotinic acid 5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 5
3.2.3. Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Kế thừa kết quả đánh giá môi trường và điều kiện nuôi cấy sâm Ngọc Linh, đề tài sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) và môi trường dinh dưỡng cơ bản SH (Schenk & Hildebrandt Basal Salt Medium) có bổ sung thêm 7g/l agar, 30g/l sucrose và các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau thuộc nhóm auxin (NAA: acid acetic naphthalene), cytokinin (BA: benzyl adenine) và gibberellin (GA3) để đánh giá khả năng phát sinh củ, rễ và lá của loài sâm Lai Châu. Môi trường sử dụng được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, pH 5,8-5,9. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi cấy 21-23oC, chu kì chiếu sáng 12-14 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 1800 – 2000 lux.
3.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Các mẫu sử dụng trong từng thí nghiệm sẽ được lựa chọn đồng đều về kích thước và số tuổi mẫu. Mẫu cấy được thực hiện trong các bình tam giác có thể tích 250ml, công thức môi trường phụ thuộc vào từng thí nghiệm. Các chỉ tiêu theo dõi phụ thuộc vào từng thí nghiệm, mỗi thí nghiệm thực hiện 3 lần nhắc lại.
3.3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.2.1. Nghiên cứu phương pháp vào mẫu tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và tạo phôi vô tính
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng của 500mg/L Streptomycin đến việc vào mẫu từ mô củ trên sâm Lai Châu.
Công thức 1: ĐC – 0 phút Công thức 2: 5 phút Công thức 3: 10 phút Công thức 4: 15 phút Công thức 5: 20 phút
Phương pháp: Lựa chọn cây sâm Lai Châu không bị sâu bệnh, rửa sạch sơ bộ bộ phận cần sử dụng dưới vòi nước sạch tránh gây tổn thương bề mặt mẫu. Dùng bông cồn 70% lau vệ sinh bề mặt củ, sau đó cắt củ ra thành từng khối vuông phù hợp ngâm trong dung dịch chứa 0,7% thiophanate methyl trong 30 phút. Tiếp theo các khối vuông được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm tiếp trong dung dịch 500mg/L Streptomycin theo các công thức khác nhau (CT1- ĐC: 0 phút; CT2: 5 phút; CT3: 10 phút; CT4: 15 phút; CT5: 20 phút). Rửa lại bằng nước cất vô trùng, rồi xử lý bằng dung dịch sodium hypochlorite 1,5% trong 15 phút. Cuối cùng rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng và để cho ráo nước. Dùng dao loại bỏ hết phần bề mặt xung quanh tiếp xúc với hóa chất khi vô trùng, rồi cắt mẫu thành từng lát mỏng có kích thước 1×5×5mm, và đưa vào môi trường nuôi cấy. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần tương ứng với 5 bình, mỗi bình 5 miếng mẫu. Quan sát và tính tỷ lệ mẫu sạch bệnh, không nhiễm nấm, nhiễm khuẩn đối với 5 công thức khử trùng trên sau 4 tuần nuôi cấy. (Hình 3.2).