Sau 4 tuần nuôi cấy mô củ tiến hành phân tích,đánh giá bảng 4.2 và đồ thị 4.2, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm giảm dần từ công thức CT1 đến công thức CT4 rồi lại tăng dần ở công thức CT5, công thức CT4 có tỷ lệ nhiễm thấp nhất khi thời gian xử lý mẫu bằng ethanol 70% là 5 phút (5%), sau đó tỷ lệ nhiễm lại tăng dần khi thời gian xử lý mẫu trong ethanol 70% tăng lên 10 phút (40%) ở công thức CT5
Khi không xử lý mẫu bằng ethanol 70% (CT1-ĐC: 0 phút), hoặc xử lý trong thời gian chưa đủ (1 phút, 3 phút) thì bề mặt mẫu vẫn chưa được vô trùng hiệu quả dẫn tới tỷ lệ nhiễm cao (100%, 30% và 20%). Ngược lại, khi xử lý mẫu lâu hơn 5 phút (10 phút) trong cồn 70% sẽ làm bề mặt chồi mầm bị tổn thương, trên mặt chồi mầm xuất hiện các vết, chấm nhỏ do nấm gây ra. Mật độ và kích thước các chấm này tăng khi thời gian xử lý tăng. Và đây cũng chính là nguyên nhân gây nhiễm khi thời gian xử lý bằng cồn 70% quá 5 phút.
Bảng 4.2. Thời gian ảnh hưởng của ethanol 70% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm chồi mầm
Công Thức Môi trường nuôi cấy Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1 (ĐC 0p) Ethanol 70% 100 CT2 (1p) 30 CT3 (3p) 20 CT4 (5p) 5 CT5 (10p) 40 LSD0,05 3,6 CV% 5,1 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 0 20 40 60 80 100 120 CT1 (ĐC 0p) CT2 (1p) CT3 (3p) CT4 (5p) CT5 (10p) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Đồ thị 4.2. Thời gian ảnh hưởng của ethanol 70% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm
Như vậy, thời gian tối ưu xử lý mẫu bằng ethanol 70% đối với mô chồi mầm cây sâm Lai Châu là 5 phút ở công thức CT4. Với lượng thời gian này, mẫu chồi mầm được vô trùng khá tốt, không gây tổn thương bề mặt, và cho tỷ lệ nhiễm thấp nhất (5,0%), sai số có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
4.1.1.3. Thí nghiệm 3: Thời gian ảnh hưởng của Thiophanate methyl 0,7% đến việc vào mẫu từ mô thân trên sâm Lai Châu
Từ kết quả nghiên cứu vào mẫu thành công tạo nguồn vật liệu in vitro từ
mô chồi mầm cây sâm Lai Châu trên cơ sở sử dụng dung dịch 70% ethanol và 1,5% sodium hypochlorite để xử lý mẫu. Qua đó nhận thấy rằng, để vào mẫu thành công từ thân của sâm Lai Châu cần kiểm soát tốt tỷ lệ nhiễm nấm là chủ
yếu. Trong nghiên cứu vào mẫu từ mô thân cây sâm Lai Châu, đề tài sử dụng chất diệt nấm 0,7% thiophanate methyl như là một khâu trong quy trình theo 5 công thức khác nhau (xem mục phương pháp).
Sau 4 tuần nuôi cấy và quan sát Bảng 4.3 và Đồ thị 4.3 cho thấy, thời gian xử lý mẫu bằng 0,7% thiophanate methyl càng dài thì tỷ lệ mẫu nhiễm càng giảm. Khi không xử lý mẫu bằng 0,7% thiophanate methyl thì tỷ lệ mẫu nhiễm là 100%. Và với thời gian xử lý 40 phút tỷ lệ nhiễm chỉ còn 8% đạt hiệu quả tốt nhất.(Bảng 4.3), sai số có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng thời gian xử lý mẫu lên vượt quá 40 phút thì tỉ lệ nhiễm mẫu lại tăng trở lại, Do mô chồi mầm non và mềm khi xử lý mẫu quá dài sẽ dẫn đến khả năng xâm nhập của nấm sẽ gia tăng cao, kết quả này khá tương tự với các kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhật và cs. (2010) trên sâm Ngọc Linh
Bảng 4.3. Thời gian ảnh hưởng của Thiophanate methyl 0,7% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm
Công Thức Môi trường nuôi cấy Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1 (ĐC 0p) Thiophanate methyl 0,7% 100 CT2 (10p) 80 CT3 (20p) 36 CT4 (30p) 20 CT5 (40p) 8 LSD0,05 2,8 CV% 3,2 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 0 20 40 60 80 100 120 CT1 (ĐC 0p) CT2 (10p) CT3 (20p) CT4 (30p) CT5 (40p) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Đồ thị 4.3. Thời gian ảnh hưởng của Thiophanate methyl 0,7% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm
Như vậy, thời gian tối ưu xử lý mẫu bằng dung dịch 0,7% thiophanate methyl đối với mô thân cây sâm Lai Châu là 40 phút. Với lượng thời gian này, mẫu thân được vô trùng khá tốt, không gây tổn thương bề mặt và cho tỷ lệ nhiễm thấp nhất chỉ là 8,0%.
4.1.2. Kết quả nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo
Sau khi vào mẫu thành công từ mô củ, mô chồi mầm và mô thân, đề tài tiến hành lựa chọn mô sẹo phát triển từ củ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
4.1.2.1. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D trong môi trường MS đến cảm ứng tạo mô sẹo
Trong nuôi cấy in vitro thực vật, sự hình thành mô sẹo là một quá trình sinh
học phức tạp, dưới tác động của các chất điều tiết sinh trưởng auxin hoặc cytokinin, các tế bào tại vị trí mô bị tổn thương phân chia hỗn độn không ngừng tạo thành khối tế bào phản biệt hóa. Quá trình này không chỉ phụ thuộc vào thành phần và nồng độ chất kích thích mà còn phụ thuộc nhiều vào kiểu gen và trạng thái tế bào ở vị trí lấy mẫu. Tế bào nào càng trẻ hóa thì càng dễ bị tác động, kích thích, quá trình tạo mô sẹo diễn ra nhanh và hiệu quả cao hơn so với tế bào già hóa.