TT Chỉ tiêu Đơn vị Mẫu phân tích Lò Ma- Khú Tú VD2 Lò Ma- Khú Tú VD4 Lò Ma- Khú Tú VD10 Lò Ma VD17 Lò Ma VD22 1 pHKCl - 3.55 3.56 3.47 3.41 3.51 2 Độ ẩm % 46.35 43.99 47.56 43.34 49.35 3 Mùn (OM) % 10.40 4.38 6.30 4.24 10.40 4 N tổng số % 0.606 0.519 0.471 0.534 0.617 5 P tổng số % P2O5 0.31 0.28 0.15 0.15 0.37 6 K tổng số % K2O 1.22 1.22 1.21 1.30 1.15 7 P dễ tiêu mgP2O5/100g đất 6.87 4.01 3.43 4.58 2.86 8 K dễ tiêu mgK2O/100g đất 11.86 14.36 9.87 18.27 11.20 Nguồn: Phan Kế Long (2013)
Ba mẫu đất còn lại là Lò Ma-Khú Tú VD4, Lò Ma-Khú Tú VD10 và Lò Ma VD17 có độ tương đồng cao về pH, độ ẩm, hàm lượng Nitơ, Photpho tổng số và dễ tiêu, Kali tổng số. Tuy nhiên hàm lượng mùn của mẫu Lò Ma-Khú Tú VD10
cao hơn nhiều so với 2 mẫu đất còn lại (6,30 %). Hàm lượng Kali dễ tiêu của mẫu Lò Ma VD17 cao nhất so với 4 mẫu đất còn lại (18,27 mg K2O/100g đất), sau đó là mẫu Lò Ma-Khú Tú VD4 với 14,36 mg K2O/100g đất.
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG SÂM
Trên thế giới, hầu hết các nghiên cứu được tiến hành trên các đối tượng thuộc chi Panax chủ yếu tập trung vào các loài cây Nhân sâm (Panax ginseng). Phôi vô tính Nhân sâm đã được cảm ứng thành công trên môi trường trực tiếp từ rễ (Asaka et al., 1993); (Chang and Hsing, 1980), lá (Tirajoh et al., 1998), lá
mầm (Choi and Soh, 1994), phôi hợp tử (Choi and Soh, 1996) hoặc gián tiếp qua trung gian mô sẹo được cảm ứng từ nuôi cấy chồi hoa (Shoyama el al.,1997).
Nghiên cứu phát sinh phôi vô tính Nhân sâm trong môi trường lỏng cũng được thực hiện bởi Claire et al. (2000), Gorpenchenko et al. (2006) đã nghiên cứu
chuyển gen rolC nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để thu nhận những
dòng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính. Nhiều phương pháp khác nhau nhằm nâng cao tỉ lệ xuất hiện phôi vô tính Nhân sâm cũng đã được nghiên cứu như nuôi cấy trong môi trường lỏng (Claire et al., 2000), sử dụng các polyamine (Claire el at., 2002), xử lý thẩm thấu (Choi and Soh, 1997).
Ở Việt Nam, trong vài năm trở lại đây, các loài sâm như: Ngọc Linh, Lai Châu … đã trở thành một đề tài nóng và là đối tượng được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Trong đó, nhiều nhất phải kể đến những nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Trung tâm sâm và dược liệu TP. Hồ Chí Minh, Viện Sinh học Nhiệt đới, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, Học viện Quân y, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Kon Tum, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Quảng Nam.
2.4.1. Nghiên cứu nhân giống từ hạt
Từ xa xưa công tác tạo nguồn giống sâm đã được thực hiện với hai hình thức chủ yếu là nhân giống từ hạt và tạo giống từ đầu mầm (thân rễ ngầm). Nhưng những kết quả đạt được còn nhiều hạn chế, lượng sâm giống tạo ra thấp, số lượng nhỏ, chất lượng chưa tốt, dễ bị hao hụt do thiên tai và dịch bệnh và khó đáp ừng được nhu cầu ngày càng cao của con người.
Trong khuôn khổ đề tài “nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống, kỹ thuật trồng và quy hoạch phát triển trồng cây sâm Ngọc Linh tại Kon Tum (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.), các nhà khoa học đến từ Viện Dược liệu và Sở Khoa
sâm Ngọc Linh từ hạt (Nguyễn Bá Hoạt, 2004). Sâm Ngọc Linh cũng như phần lớn những loài cây khác là nhân giống được từ hạt, tuy nhiên, các tác giả cho rằng việc nhân giống từ hạt này mang một số đặc thù riêng. Trong đó, quá trình thu quả chín là yếu tố chính quyết định đến tỷ lệ nảy mầm (tỷ lệ nảy mầm đạt tối đa là 94%). Quy trình sản xuất giống từ hạt rất đơn giản, song công tác chuẩn bị đất cho vườn ươm phải được chú trọng bởi nó cần có hàm lượng mùn tự nhiên cao. Có thể rút ngắn được thời gian ngủ của hạt và đặc biệt là cây giống trong vườn ươm cũng như trong vườn trồng sẽ phát triển sớm hơn, thuận lợi hơn.
2.4.2. Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro các loài sâm thuộc chi Panax
2.4.2.1.Trên Thế Giới
Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng lên khả năng tạo callus và phát sinh phôi của P. japonicus đã vào mẫu bằng chồi hoa, cành và lá và thân rễ của P. japonicus, mẫu được rửa bằng nước máy, khử trùng bề mặt
bằng dung dịch natri hypoclorit 2% chứa 0,l% Tween 80 trong 10 phút, sau đó với cồn 70% trong 30 giây và cuối cùng rửa kỹ hai lần bằng nước đã khử trùng. Kết quả cho thấy callus tạo thành từ chồi hoa có tỉ lệ phát sinh phôi cao nhất đạt 80%, trong môi trường MS bổ sung 1mg/l 2,4-D, tiếp đó là callus từ lá, cành và rễ. Môi trường phù hợp nhất cho phôi nảy mầm là MS bổ sung 2 mg/l NAA và 10 mg/l BAP cho tỉ lệ nảy mầm đạt 100 %.(Shoyama, 1997)
Shoyama (1997) khi nghiên cứu nhân giống invitro P. ginseng, mẫu chồi
hoa, cành và lá được nuôi cấy trên môi trường MS chứa 1mg/l 2,4-D trong tối, phôi được chuyển tới môi trường ½ MS 3% sucrose chứa 0,5 mg/l GA và 0,5 mg/l để tạo chồi. Tỉ lệ callus hình thành từ chồi hoa cao hơn so với lá và cành.
Zhang (1996) khi khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường lên khả năng tổng hợp saponin của P. ginseng đã sử dụng môi trường MS có bổ sung 2 mg/l 2,4 D; 0.7 mg kinetic, 60mM KNO3 là nguồn nitrogen duy nhất. Tác giả nhận thấy việc bổ sung 40 g/lit sucrose cho lượng sinh khối tế bào lớn nhất, sinh khối khô đạt 11.9 g/l sau 29 ngày nuôi cấy.
Sau đó Zhang (1996) tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nguồn và tỉ lệ nitrogen đến sự tổng hợp saponin trong nuôi cấy tế bào tam thất P. notoginseng đã sử dụng môi trường MS bổ sung 1mg/l 2,4-D; 0,1 g kinetin và 30g sucrose pH 5,8. Nhân tế bào sâm trong bình tam giác 250 ml chứa 50ml môi trường lắc ở 110 vòng/phút ở 25oC trong tối. Cấy vào mỗi bình 3,5 gam tế bào sâm, bổ sung
nitrogen tổng 60 mM NO3- hoặc bổ sung đơn NO3 /NH4+ (2:1) 10 mM cho khả năng tích lũy sinh khối lớn nhất.
Choi (1998) nghiên cứu tạo chồi bất định P. ginseng, hạt giống sau khi đã
phân tầng được ngâm trong cồn 70o 1 phút, khử trùng trong 1% NaOCl trong 1 h và sau đó rửa sạch ba lần bằng nước cất vô trùng, phôi được nảy mầm trong môi trường MS chứa 30g sucrose. Chồi bất định được tạo ra nhiều nhất trên môi trường MS bổ sung 0.05 mg/l IBA và 5 mg/l BAP.
Kevers (2000) vào mẫu P. ginseng từ rễ, rễ được khử trùng trong ethanol
70o trong 3 phút sau đó trong NaClO 3% trong 20 phút và rửa 3 lần với nước cất vô trùng. Callus được hình thành trong môi trường MS chứa 1 mg/l 2,4D, phôi nảy mầm trong môi trường 1/2MS bổ sung 3 mg/l BSAA và 0,2 mg/l ZR.
Tang (2000) khử trùng hạt P. ginseng bằng cách ngâm trong cồn 70oC trong 30s, khử trùng bằng 0,1% HgCl2 15 phút, phôi hạt sau đó được nhân lên trên môi trường MS chứa 0,5 mg/l 2,4D; 500mg/l lactalbumin hydrolysate và 30g sucrose, phôi nảy mầm trong môi trường SH 0,5 mg/l α-naphthaleneacetic acid; 0,1 mg/l BA và 500 mg/l casein hydrolysate.
Uchendu (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các auxin và cytokinin đến sự tạo phôi của sâm Mỹ P. quinquefolius theo đó 2.5mg/l TDZ và 0,5mg/l NAA cho hiệu quả tốt nhất.
Kochan (2010) phát sinh callus P. quinquefolius trên môi trường MS với
2,4D 1 mg/l; NAA 1 mg/l; BAP 0,5 mg/l và 50 g/l sucrose trong tối. Sinh khối được nhân trong môi trường MS lỏng chứa 2,4-D 0.2 mg/l và TDZ 0.002 mg/l, lắc 100 vòng/phút trong 40 ngày. Trong nghiên cứu sau đó Konchan vào mẫu sâm Mỹ P. quinquefolius bằng cách rửa mẫu bằng dòng nước chảy sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 70o và 2,5% hypochloride trong 2-3 phút cuối cùng rủa lại nhiều lần bằng nước khử trùng.
Đối với tam thất, Shoyama (1997) đã tạo phôi có nguồn gốc từ nụ hoa non thông qua mô sẹo trong vòng 18 tuần, phôi soma sau đó được nảy mầm trên môi trường 1/2MS bổ sung 0,5mg/l GA3 và 0,5mg/l BA trong vòng 6 tuần, rễ được hình thành trên môi trường MS chứa 1mg/l NAA trong vòng 1 tháng. Tác giả đã sửu dụng chỉ thị SSR phân tích tính đồng nhất di truyền của \các cây con in-vitro so với cây mẹ và nhận thấy không có sự biến đổi về mặt di truyền ở cây tạo ra theo phương pháp nhân giống vô tính.
You (2012) phát triển phương pháp nhân giống quy mô lớn P. notoginseng
bằng cách sử dụng lỏng lắc và bioreactor, tái sinh thành công cây con trong điều kiện ex-vitro. Phôi có nguồn gốc từ callus của rễ trên môi MS có chứa 1,0 mg/l 2,4-D sau 5 tuần nuôi cấy. Tần số cao nhất (100%) của phôi soma, với trung bình 32,7 phôi soma trên mỗi mô sẹo, thu được trên callus phôi được ủ trên môi trường có chứa 0,5 mg / L 2,4-D. Để tăng tỷ lệ hình thành phôi soma, 10g phôi soma giai đoạn hình cầu được chuyển vào bioreacter l chứa 1,5 l môi trường 1/2MS không bổ sung chất điều tiết sinh tưởng trong thời gian 4 tuần; những phôi soma giai đoạn hình cầu này sau đó phát triển thành phôi mầm. Tuy nhiên, trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng phôi mầm chỉ phát triển rễ nhưng không phát triển chồi. Phôi cần chuyển sang môi trường 1/2 MS với 2.0 mg/l GA3 trong 2 tuần để kích nảy mầm thành cây.
2.4.2.2. Tại Việt Nam
Nguyễn Ngọc Dung là một trong những tác giả đầu tiên nghiên cứu nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học thông qua tái sinh từ mô sẹo (Nguyễn Ngọc Dung, 1995). Dương Tấn Nhựt và cs. (2010) cũng đã tiến hành nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh thông qua con đường phát sinh cơ quan. Trong nghiên cứu này quy trình nhân giống in vitro và trồng thử nghiệm ở giai đoạn vườn ươm đã được trình bày. Mô sẹo được cảm ứng ở các mẫu củ sâm Ngọc Linh cắt mỏng trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp 0,2 mg/l TDZ. Số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 2 g/l than hoạt tính. Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½MS được bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose, 2,0 g/l than hoạt tính, trong điều kiện ánh sáng đèn LED 70% đỏ và 30% xanh là tốt nhất. 1000 cây sâm in vitro sau 6 tháng trồng ngoài khu vực vườn ươm cho thấy tốc độ sinh trưởng là nhanh hơn so với cây sâm Ngọc Linh gieo bằng hạt với tỷ lệ sống sót là 87%.
Nguyễn Bảo Triệu và cs. (2013) cũng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in
vitro sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 0,2 mg/l TDZ
và trên môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA. Mai Trường và cs. (2014) đã tiến hành nghiên cứu về tạo và nhân phôi soma sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng. Lá cây in vivo (sau khử trùng) được nuôi cấy trên môi trường
MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 0,2 mg/l kinetin để tạo mô sẹo. Sau đó, mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường MS lỏng (lắc) bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 0,2 mg/l kinetin, 500 mg/l casein hydrolysate để tạo huyền phù tế bào. Sau 2 tháng, huyền phù tế bào được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường B5 lỏng (lắc) có 3,0 mg/l IBA. Mảnh lá mầm (của cây mầm từ phôi) và phôi soma non được nuôi cấy trên môi trường MS có 10% nước dừa (v/v), có hoặc không có 0,2 mg/l IBA để tạo mô sẹo sinh phôi và phôi thứ cấp. Mô sẹo sinh phôi và phôi thứ cấp này cũng đã được dùng để nuôi nhân trong môi trường lỏng có và không có chất điều tiết sinh trưởng ở quy mô bình tam giác và bioreactor. Những kết quả đã tạo cơ sở để nhân giống quy mô lớn và thu hợp chất thứ cấp.
Hoàng Xuân Chiến và cs. (2011) đã thử nghiệm khả năng tạo củ in vitro và xác định hàm lượng saponin ở các cây trồng thử nghiệm 17 tháng tuổi. Các hệ phức hợp của GA/ABA và auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng được các tác giả khảo sát. Nồng độ ABA thích hợp nhất cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l. GA3 ức chế khả năng tạo củ in vitro cây sâm Ngọc Linh. Các chồi cây sâm Ngọc Linh in vitro được cảm ứng để tạo củ thành công trên môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 2,0 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Nồng độ đường sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ sâm là 50 g/l. Hàm lượng saponin trong củ của những cây 17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng đã được xác định là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%), MR2 (0,77%) (Hoàng Xuân Chiến và cs., 2011). Dương Tấn Nhựt và cs. (2012) đã công bố các dạng phát sinh hình thái khác nhau (phôi vô tính, mô sẹo, chồi và rễ) có thể được cảm ứng từ các mẫu cấy rễ chính của sâm Ngọc Linh thông qua phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào. Môi trường thích hợp nhất để cảm ứng sự hình thành phôi vô tính là môi trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ. Môi trường MS bổ sung1,0 mg/l BA và 0,1 mg/l 2,4-D cảm ứng sự tái sinh chồi dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày trong khi môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l NAA cảm ứng tạo rễ tốt nhất trong điều kiện tối hoàn toàn.
Hoàng Xuân Chiến và cs. (2011) đã thử nghiệm khả năng tạo củ in vitro và xác định hàm lượng saponin ở các cây trồng thử nghiệm 17 tháng tuổi. Các hệ phức hợp của GA/ABA và auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng được các tác giả khảo sát. Nồng độ ABA thích hợp nhất cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l. GA3 ức chế khả năng tạo củ in vitro cây sâm Ngọc Linh. Các chồi cây sâm Ngọc Linh in vitro được cảm ứng để tạo củ thành công trên môi trường SH
có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 2,0 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Nồng độ đường sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ sâm là 50 g/l. Hàm lượng saponin trong củ của những cây 17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng đã được xác định là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%), MR2 (0,77%).
Dương Tấn Nhựt và cs. (2012) đã công bố các dạng phát sinh hình thái khác nhau (phôi vô tính, mô sẹo, chồi và rễ) có thể được cảm ứng từ các mẫu cấy rễ chính của sâm Ngọc Linh thông qua phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào. Môi trường thích hợp nhất để cảm ứng sự hình thành phôi vô tính là môi trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ. Môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,1 mg/l 2,4-D cảm ứng sự tái sinh chồi dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày trong khi môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l NAA cảm ứng tạo rễ tốt nhất trong điều kiện tối hoàn toàn.
2.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN
GIỐNG IN VITRO
2.5.1. Chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng trong hầu hết các hệ thống nuôi cấy phôi vô tính. Trong thực nghiệm nuôi cấy khởi đầu thường dùng những phạm vi rất hẹp chất điều tiết sinh trưởng được đưa vào môi trường.
Loại auxin tổng hợp như 2,4-D được dùng phổ biến trong những nuôi cấy ban đầu. Những auxin khác cũng được sử dụng như IBA, picloram, các auxin yếu là NAA và IAA được dùng trong một vài hệ thống nuôi cấy. Auxin được dùng cho cảm ứng hình thành tế bào phát triển phôi, có lẽ do hoạt hóa phân hóa gen khởi đầu và cũng thúc đẩy tăng quần thể tế bào qua phân bào liên tiếp, đồng thời ngăn cản sinh trưởng và biệt hóa tế bào thành các phôi. Trong trường hợp mẫu cấy có chứa