Sau thời gian nghiên cứu và theo dõi ta thấy, phôi vô tính đều được tạo ra ở các công thức còn lại. Tuy nhiên tỷ lệ tạo thành phôi ở các công thức đã có sự khác nhau (Bảng 4.7).
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của 2,4-D, NAA và TDZ đến sự tạo thành phôi vô tính từ mô sẹo có khả năng sinh phôi
Công thức trường Môi
Tỷ lệ phôi vô tính tạo ra (%) Tỷ lệ phôi vô tính/mô sẹo(%) CT1 : 0 mg/L NAA + 0 mg/L TDZ MS + 30 g/L sucrose + 1.0 mg/L 2,4 - D 0 0 CT2 : 0,5 mg/L NAA + 0,1 mg/L TDZ 43,0 13,6 CT3 : 0,5 mg/L NAA + 0,3 mg/L TDZ 82,6 19,5 CT4 : 0,5 mg/L NAA + 0,5 mg/L TDZ 59,3 15,3 CT5 : 0,5 mg/L NAA + 1.0 mg/L TDZ 22,5 14,1 CT6 : 1,0 mg/L NAA + 0,1 mg/L TDZ 46,0 12,6 CT7 : 1,0 mg/L NAA + 0,3 mg/L TDZ 82,5 18,5 CT8 : 1,0 mg/L NAA + 0,5 mg/L TDZ 83,6 19,9 CT9 : 1,0 mg/L NAA + 1,0 mg/L TDZ 21,5 12,1 LSD0,05 2,8 2,0 CV% 3,4 4,8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9
Tỷ lệ phôi vô tính tạo ra (%)
Tỷ lệ phôi vô tính/mô sẹo(%)
Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng của 2,4-D, NAA và TDZ đến sự tạo thành phôi vô tính từ mô sẹo có khả năng sinh phôi
Quan sát đồ thị 4.4 ta thấy, tỷ lệ phôi vô tính tạo ra đã có sự biến đổi nhất định qua các công thức từ 21,5% - 83,6%, thấp nhất ở công thức CT9 đạt 21,5%, cao nhất ở công thức CT8 là 83,6%. Các công thức CT3, CT7, CT8 có tỷ lệ phôi
tạo ra theo thứ tự là 82,6%; 82,5%; 83,6%, tuy nhiên sai số không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Tỷ lệ phôi vô tính/mô sẹo dao động từ 12,1% - 19,9%, cao nhất ở CT8 là 19,9% và thấp nhất ở công thức 9 đạt 12,1%. Các công thức CT3, CT7, CT8 có tỷ lệ phôi/mô lần lượt là 19,5%; 18,5%; 19,9%, điều này chứng tỏ nồng độ NAA và TDZ phải có sự kết hợp hợp lý với nhau mới cho kết quả tốt nhất, sai số không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Tuy nhiên, để tiết kiệm chi phí trong quá trình nghiên cứu và sản xuất, môi trường tối ưu để tạo phôi vô tính từ mô sẹo sâm Lai Châu là công thức CT3 (MS+30g /Lsucrose+1,0mg/L 2,4-D+0,5 mg/L NAA+ 0,3 mg/L TDZ).
4.2. GIAI ĐOẠN TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG PHÁT SINH HÌNH THÁI CỬ MICRO, RỄ VÀ LÁ CÁC MẪU SÂM LAI CHÂU SINH HÌNH THÁI CỬ MICRO, RỄ VÀ LÁ CÁC MẪU SÂM LAI CHÂU 4.2.1. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nảy mầm phôi soma
Trên môi trường cảm ứng, phôi soma phát triển rất chậm, đôi khi ngừng sinh trưởng hoặc bắt đầu quá trình hình thành phôi thứ cấp. Tất cả điều đó dẫn tới kích thước phôi nhỏ, phôi trưởng thành không thể nảy mầm thành cây con có đầy đủ chồi và rễ củ. Nhắc đến Cytokinin chúng ta biết đến là một nhóm hợp chất kích thích sự tái sinh chồi ở các đoạn cắt, mô sẹo trong nuôi cấy in vitro. Trong nhóm chất điều tiết sinh trưởng Cytokinin, BA được sử dụng rộng rãi trên các đối tượng khác nhau dựa vào tác động rõ rệt của nó lên sự hình thành chồi bất định. Đề tài mở rộng khảo sát ảnh hưởng riêng lẻ của BA lên sự tái sinh chồi từ phôi trên các mẫu sâm lưu giữ.
Trong khi cytokinin kích thích sự tổng hợp diệp lục tố trong mô sẹo và huyền phù tế bào thì auxin lại là yếu tố ngăn cản. Khi so sánh IAA và NAA thì hai loại này ít có tác dụng ngăn cản sự tổng hợp diệp lục tố hơn là 2,4 D. Auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích tạo mô sẹo. Ngoài ra Auxin còn phân tách các tế bào trong huyền phù tế bào và làm cho các tế bào kết dính lại với nhau. Nồng độ trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự phát sinh phôi soma từ các tế bào có khả năng sinh phôi. Auxin và cytokinin, đặc biệt là tỷ lệ giữa chúng đóng một vai trò cần cho việc tái sinh chồi. Cytokinin thường thúc đẩy hoạt động hình thành chồi và quá trình này thường gia tăng bởi nồng độ auxin thấp. Trong thí nghiệm này, khi kết
hợp giữa auxin và cytokinin nhận thấy có sự khác biệt đáng kể trong các tổ hợp NAA và BA khác nhau.
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của BA và NAA trong môi trường MS lên khả năng nảy mầm phôi soma và phát triển thành cây in vitro với củ micro thể hiện cụ thể ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nảy mầm phôi soma sâm Lai Châu
Công thức Môi Trường Số lượng chồi/ mẫu(chồi) Khối lượng chồi (mg) CT1 :0 mg/L BA + 0 mg/L NAA MS 0 0 CT2 :0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA 5,0 0,106 CT3 :0,5 mg/L BA + 1 mg/L NAA 6,1 0,141 CT4 :0,5 mg/L BA + 1,5 mg/L NAA 4,6 0,193 CT5 :0,5 mg/L BA + 2,0 mg/L NAA 3,3 0,197 CT6 :1 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA 6,9 0, 185 CT7 :1 mg/L BA + 1,0 mg/L NAA 5,5 0,163 CT8 :1 mg/L BA + 1,5 mg/L NAA 5,9 0,158 CT9 :1 mg/L BA + 2,0 mg/L NAA 3,9 0,148 LSD0,05 0,6 0,04 CV% 5,7 1,1
Sau 6 tuần tiến hành nghiên cứu và theo dõi ta thấy, tỷ lệ số lượng chồi/mẫu và khối lượng chồi biến đổi theo nồng độ dung dịch BA và NAA. Tại môi trường MS không có sự bổ sung BA và NAA thì phôi không có khả năng nảy mầm. Các môi trường còn lại đều nảy mầm thành thành công số lượng chồi dao động từ 3,3 chồi – 6,9 chồi. Số lượng chồi/mẫu thấp nhất ở công thức CT5 (MS +0,5 mg/L BA + 2,0 mg/L NAA) đạt 3,3 chồi/mẫu. Đặc biệt ở công thức CT6 với nồng độ BA và NAA (1,0 mg/L và 0,5 mg/L) đạt kết quả tốt nhất là 6,9 chồi/mẫu, sai số có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. 3 công thức CT3, CT7, CT8 cho số lượng chồi/mầm đạt lần lượt 6,1; 5,5 ; 5,9, tuy nhiên sai số không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Khối lượng chồi dao động từ 0,106mg – 0,197mg, khối lượng chối thấp nhất ở công thức CT2(MS+0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA) đạt 0,106 mg, Công thức CT3 (MS+CT5 :0,5 mg/L BA + 2,0 mg/L NAA) có khối lượng cao nhất so
với các công thức còn lại 0,197mg, tuy nhiên 4 công thức CT4, CT5, CT6, CT7 cho khối lượng lần lượt là 0,193 mg; 0,197 mg; 0,185 mg; 0,163 mg có sai số không có ý nghĩa thống kê ở mực độ tin cậy 95%.
Tóm lại, môi trường tối ưu và tốt nhất cho khả năng tái sinh chồi từ phôi ở sâm Lai Châu là công thức CT6 có môi trường MS có bổ sung BA và NAA với nồng độ tương ứng là 1 mg/l: 0,5 mg/l.
4.2.2. Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng GA3 so với NAA và BA đến khả năng nảy mầm phôi soma và phát triển thành so với NAA và BA đến khả năng nảy mầm phôi soma và phát triển thành cây in vitro với củ micro
Để tối ưu khả năng nảy mầm phôi soma và phát triển thành cây in vitro với củ micro (củ mini), đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của chất GA3 so với nồng độ tốt nhất ở thí nghiệm trên là 0,5mg/L NAA, và 1mg/L BA đến khả năng nảy mầm của phôi thành cây con in vitro với củ micro (củ mini).
Đánh giá tỷ lệ nảy mầm (Hình 4.7) và phát triển của phôi thành cây con sau 6 tuần nuôi cấy trên sâm Lai Châu, kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.9.