mô thân
Trong kỹ thuật nuôi cấy in vitro mô thực vật, bước vào mẫu tạo vật liệu vô trùng đóng vai trò rất quan trọng, nó là tiền đề để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo, chẳng hạn như tái sinh trực tiếp hoặc tạo mô sẹo (callus), biệt hóa tế bào mô sẹo thành phôi, chồi, hay rễ. Tuy nhiên, các qui trình vào mẫu tạo vật liệu sạch bệnh không giống nhau, mà nó phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu, cơ quan bộ phận dùng làm mô cấy, cũng như loại hóa chất và cách thức sử dụng khi khử trùng.
Đối với cây tinh dầu và cây dược liệu thì quá trình vào mẫu là tương đối khó khăn, tỷ lệ nhiễm khuẩn và nhiễm nấm nội sinh của mẫu cấy rất cao. Theo nhiều nhà nghiên cứu, cây dược liệu có chứa nhiều hợp chất trao đổi thứ cấp, hợp chất phenolic là nguyên nhân gây khó khăn cho việc vào mẫu. Để vào mẫu thành công cây dược liệu các nhà nghiên cứu đã sử dụng dung dịch 0,2% HgCl2, kháng sinh penicillin, dung dịch sodium hypochlorite, 70% ethanol …để xử lý mẫu theo qui trình riêng(Zhou et al., 2006; Duong Tan Nhut et al., 2012; Zhang et al., 2015).
Trong các loại vật liệu để vào mẫu như củ, chồi mầm, thân lá thì vật liệu củ thường dễ thu thập và bảo quản nhất. Tuy nhiên, củ thường nằm ở trong đất thường rất bẩn và nhiễm một số loại vi khuẩn nội sinh khác nhau nên cần sử dụng thuốc diệt khuẩn streptomycin, cồn để lau mẫu và thiophanate methyl trong 30 phút. Về chồi mầm là phần ở trên mặt đất nên khá sạch sẽ, các mô của chồi mầm thường rất non và rất rễ bị tổn thương nên không thể dùng Streptomycin như với củ được, thay vào đó đề tài sử dụng ethanol 70% để nghiên cứu. Cuối cùng là mô thân cũng là mô non nên không thể sử dụng Streptomycin, mô thân rất dễ bị nhiễm nấm nên tiến hành sử dụng 0,7% thiophanate methyl để nghiên cứu vào mẫu và thử nghiệm.
4.1.1.1. Thí nghiệm 1: Thời gian ảnh hưởng của 500mg/L Streptomycin đến việc vào mẫu từ mô củ trên sâm Lai Châu
Trong nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh từ mô củ, đề tài sử dụng cồn để lau mẫu củ, và dung dịch kháng sinh streptomycin 500 mg/L theo các công thức
thời gian khác nhau (xem mục phương pháp). Theo dõi và quan sát sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả nhận thấy, yếu tố gây nhiễm mẫu mô củ (thân rễ) chủ yếu là do vi khuẩn nội sinh (Hình 4.1). Mẫu không được xử lý bằng streptomycin 500mg/L (CT1-ĐC) bị nhiễm khuẩn từ rất sớm (vào ngày thứ 3 sau cấy), sau đó tăng mạnh và đến ngày thứ 10 các bình đã bị nhiễm khuẩn 100%. Đối với công thức (CT2, CT3, CT4, CT5) vô trùng mẫu còn lại, hiện tượng nhiễm khuẩn xuất hiện muộn hơn vào ngày thứ 7 sau cấy. Hiện tượng nhiễm này tiếp tục gia tăng trong tuần thứ 2 và từ tuần thứ 3 trở đi quan sát không thấy xuất hiện thêm mẫu nhiễm, kết quả này khá tương tự với các kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhật và cs. (2010) trên sâm Ngọc Linh. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1
Hình 4.1. Mẫu cấy nhiễm khuẩn
Bảng 4.1.Thời gian ảnh hưởng của 500mg/L Streptomycin đến việc vào mẫu từ mô củ
Công Thức Môi trường nuôi cấy Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1(ĐC – 0p) Dung dịch chứa 500 mg/L Streptomycin 100 CT2(5p) 91 CT3(10p) 50 CT4(15p) 10 CT5(20p) 14 LSD0.05 3,4 CV% 3,5
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 0 20 40 60 80 100 120 CT2( 5p) CT3( 10p) CT4( 15p) CT5( 20p) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Đồ thị 4.1. Thời gian ảnh hưởng của 500 mg/L Streptomycin đến việc vào mẫu từ mô củ
Sau 4 tuần nuôi cấy mô củ tiến hành phân tích và đánh giá, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm giảm dần từ công thức CT1 đến công thức CT4 sau đó lại tăng ở công thức CT5 (Đồ thị 4.1), đạt lớn nhất là 100% ở công thức đối chứng khi không sử lý bằng 500mg/L Streptomycin và giảm dần đạt cực tiểu khi thời gian xử lý mẫu bằng 500mg/L Streptomycin là 15 phút, khi tiếp tục kéo dài thời gian sử lý mẫu tỷ lệ nhiễm lại tăng dần (Bảng 4.1). Lý giải cho việc này là khi không xử lý mẫu bằng 500mg/L Streptomycin (CT1-ĐC: 0 phút), hoặc xử lý trong thời gian chưa đủ (5 phút, 10 phút) thì bề mặt mẫu vẫn chưa được vô trùng hiệu quả dẫn tới tỷ lệ nhiễm cao(100%, 90%, 50%). Còn khi xử lý mẫu 15, 20 phút trong dung dịch 500mg/L Streptomycin thì tỷ lệ nhiễm mẫu không đáng kể chỉ là 10%, 15%, còn khi kéo dài thời gian xử lý bề mặt mẫu, hóa chất sẽ ngầm sâu vào mô và làm mẫu bị tổn thương dẫn đến tỷ lệ nhiễm lại tăng dần. Sai số có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian xử lý mẫu tối ưu nhất bằng dung dịch 500 mg/L Streotomycin là 15 phút đối với mô được lấy từ củ, tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ là 10%.
4.1.1.2. Thí nghiệm 2: Thời gian ảnh hưởng của ethanol 70% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm trên sâm Lai Châu
Ngoài bộ phận vào mẫu là mô củ, mô chồi mầm thường được sử dụng để vào mẫu vì mô còn non, khả năng tạo mô sẹo cao và nhanh hơn khi vào mẫu từ mô củ. Tuy nhiên, do mô còn non nên quá trình vô trùng mẫu gặp nhiều khó khăn do dễ làm tổn thương mẫu. Trong nghiên cứu vào mẫu từ mô chồi mầm sâm Lai Châu, đề tài sử dụng dung dịch ethanol 70% theo 5 công thức khác nhau (xem mục phương pháp). Theo dõi và quan sát sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy hiện tượng mẫu nhiễm gia tăng mạnh trong 2 tuần đầu, sau đó giảm dần, và từ tuần thứ 4 trở đi thì không xuất hiện thêm mẫu bị nhiễm. Hiện tượng nhiễm ở các lát cắt mô chồi mầm chủ yếu là do nấm gây ra, ban đầu nấm xuất hiện ở viền xung quanh mẫu, sau đó lan dần bao phủ kín bề mặt mẫu và làm chết mẫu, kết quả này khá tương tự với các kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhật và cs. (2010) trên sâm Ngọc Linh (Hình 4.2).
Hình 4.2. Mẫu cấy nhiễm nấm
Sau 4 tuần nuôi cấy mô củ tiến hành phân tích,đánh giá bảng 4.2 và đồ thị 4.2, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm giảm dần từ công thức CT1 đến công thức CT4 rồi lại tăng dần ở công thức CT5, công thức CT4 có tỷ lệ nhiễm thấp nhất khi thời gian xử lý mẫu bằng ethanol 70% là 5 phút (5%), sau đó tỷ lệ nhiễm lại tăng dần khi thời gian xử lý mẫu trong ethanol 70% tăng lên 10 phút (40%) ở công thức CT5
Khi không xử lý mẫu bằng ethanol 70% (CT1-ĐC: 0 phút), hoặc xử lý trong thời gian chưa đủ (1 phút, 3 phút) thì bề mặt mẫu vẫn chưa được vô trùng hiệu quả dẫn tới tỷ lệ nhiễm cao (100%, 30% và 20%). Ngược lại, khi xử lý mẫu lâu hơn 5 phút (10 phút) trong cồn 70% sẽ làm bề mặt chồi mầm bị tổn thương, trên mặt chồi mầm xuất hiện các vết, chấm nhỏ do nấm gây ra. Mật độ và kích thước các chấm này tăng khi thời gian xử lý tăng. Và đây cũng chính là nguyên nhân gây nhiễm khi thời gian xử lý bằng cồn 70% quá 5 phút.
Bảng 4.2. Thời gian ảnh hưởng của ethanol 70% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm
Công Thức Môi trường nuôi cấy Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1 (ĐC 0p) Ethanol 70% 100 CT2 (1p) 30 CT3 (3p) 20 CT4 (5p) 5 CT5 (10p) 40 LSD0,05 3,6 CV% 5,1 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 0 20 40 60 80 100 120 CT1 (ĐC 0p) CT2 (1p) CT3 (3p) CT4 (5p) CT5 (10p) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Đồ thị 4.2. Thời gian ảnh hưởng của ethanol 70% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm
Như vậy, thời gian tối ưu xử lý mẫu bằng ethanol 70% đối với mô chồi mầm cây sâm Lai Châu là 5 phút ở công thức CT4. Với lượng thời gian này, mẫu chồi mầm được vô trùng khá tốt, không gây tổn thương bề mặt, và cho tỷ lệ nhiễm thấp nhất (5,0%), sai số có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
4.1.1.3. Thí nghiệm 3: Thời gian ảnh hưởng của Thiophanate methyl 0,7% đến việc vào mẫu từ mô thân trên sâm Lai Châu
Từ kết quả nghiên cứu vào mẫu thành công tạo nguồn vật liệu in vitro từ
mô chồi mầm cây sâm Lai Châu trên cơ sở sử dụng dung dịch 70% ethanol và 1,5% sodium hypochlorite để xử lý mẫu. Qua đó nhận thấy rằng, để vào mẫu thành công từ thân của sâm Lai Châu cần kiểm soát tốt tỷ lệ nhiễm nấm là chủ
yếu. Trong nghiên cứu vào mẫu từ mô thân cây sâm Lai Châu, đề tài sử dụng chất diệt nấm 0,7% thiophanate methyl như là một khâu trong quy trình theo 5 công thức khác nhau (xem mục phương pháp).
Sau 4 tuần nuôi cấy và quan sát Bảng 4.3 và Đồ thị 4.3 cho thấy, thời gian xử lý mẫu bằng 0,7% thiophanate methyl càng dài thì tỷ lệ mẫu nhiễm càng giảm. Khi không xử lý mẫu bằng 0,7% thiophanate methyl thì tỷ lệ mẫu nhiễm là 100%. Và với thời gian xử lý 40 phút tỷ lệ nhiễm chỉ còn 8% đạt hiệu quả tốt nhất.(Bảng 4.3), sai số có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng thời gian xử lý mẫu lên vượt quá 40 phút thì tỉ lệ nhiễm mẫu lại tăng trở lại, Do mô chồi mầm non và mềm khi xử lý mẫu quá dài sẽ dẫn đến khả năng xâm nhập của nấm sẽ gia tăng cao, kết quả này khá tương tự với các kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhật và cs. (2010) trên sâm Ngọc Linh
Bảng 4.3. Thời gian ảnh hưởng của Thiophanate methyl 0,7% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm
Công Thức Môi trường nuôi cấy Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1 (ĐC 0p) Thiophanate methyl 0,7% 100 CT2 (10p) 80 CT3 (20p) 36 CT4 (30p) 20 CT5 (40p) 8 LSD0,05 2,8 CV% 3,2 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 0 20 40 60 80 100 120 CT1 (ĐC 0p) CT2 (10p) CT3 (20p) CT4 (30p) CT5 (40p) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Đồ thị 4.3. Thời gian ảnh hưởng của Thiophanate methyl 0,7% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm
Như vậy, thời gian tối ưu xử lý mẫu bằng dung dịch 0,7% thiophanate methyl đối với mô thân cây sâm Lai Châu là 40 phút. Với lượng thời gian này, mẫu thân được vô trùng khá tốt, không gây tổn thương bề mặt và cho tỷ lệ nhiễm thấp nhất chỉ là 8,0%.