3.2.1. Vật liệu
Nguồn vật liệu ban đầu sử dụng trong nghiên cứu này là mẫu củ sâm Lai Châu 7 năm tuổi thu thập tại Mường Tè, Lai Châu trong nội dung nghiên cứu của đề tài « Nghiên cứu xây dựng bộ chỉ thị phân tử phục vụ giám định, khai thác và phát triển sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) ».
3.2.2. Hóa chất
Các thành phần khoáng đa lượng (N, P, K, Ca, Mg, S), khoáng vi lượng (Fe, Cu, Mn, Mo, B, I, Co, Zn), vitamin, các nguồn carbohydrate (sucrose) dùng để pha chế môi trường nuôi cấy được mua từ hãng hóa chất Sigma (Mỹ). Ngoài môi trường nuôi cấy cơ bản có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA (acid acetic naphthalene), cytokinin (BA: benzyl adenine) và gibberellin (GA3) và than hoạt tính. Môi trường chính được sử dụng trong nghiên cứu là Schenk and Hildebrandt (SH) và Murashige and Skoog.
Bảng 3.1. Thành phần môi trường MS Thành phần vi lượng mg/l µM CoCl2.6H2O 0,025 0,11 CuSO4.5H2O 0,025 0,1 FeNaEDTA 36,7 100 H3BO3 6,2 100,27 KI 0,83 5 MnSO4.H2O 16,9 100 Na2MoO4.2H2O 0.25 1,03 ZnSO4.7H2O 8,6 29,91 Thành phần đa lượng mg/l mM CaCl2 332,02 2,99 KH2PO4 170 1,25 KNO3 1900 18,79 MgSO4 180,54 1,5 NH4NO3 1650 20,61 Vitamins mg/l µM Glycine 2 26.64 myo-Inositol 100 554,94 Nicotinic acid 0,5 4,06 Pyridoxine HCl 0,5 2,43 Thiamine HCl 0,1 0,3
Bảng 3.2. Thành phần môi trường SH Thành phần vi lượng mg/l CoCl2.6H2O 0,1 CuSO4.5H2O 0,2 FeNaEDTA 19,8 H3BO3 5 KI 1 MnSO4.H2O 10 Na2MoO4.2H2O 0,1 ZnSO4.7H2O 1 Thành phần đa lượng mg/l CaCl2 151 KNO3 2500 MgSO4 195,05 (NH4)H2PO4 300 Vitamins mg/l myo-Inositol 1000 Nicotinic acid 5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 5
3.2.3. Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Kế thừa kết quả đánh giá môi trường và điều kiện nuôi cấy sâm Ngọc Linh, đề tài sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) và môi trường dinh dưỡng cơ bản SH (Schenk & Hildebrandt Basal Salt Medium) có bổ sung thêm 7g/l agar, 30g/l sucrose và các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau thuộc nhóm auxin (NAA: acid acetic naphthalene), cytokinin (BA: benzyl adenine) và gibberellin (GA3) để đánh giá khả năng phát sinh củ, rễ và lá của loài sâm Lai Châu. Môi trường sử dụng được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, pH 5,8-5,9. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi cấy 21-23oC, chu kì chiếu sáng 12-14 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 1800 – 2000 lux.
3.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Các mẫu sử dụng trong từng thí nghiệm sẽ được lựa chọn đồng đều về kích thước và số tuổi mẫu. Mẫu cấy được thực hiện trong các bình tam giác có thể tích 250ml, công thức môi trường phụ thuộc vào từng thí nghiệm. Các chỉ tiêu theo dõi phụ thuộc vào từng thí nghiệm, mỗi thí nghiệm thực hiện 3 lần nhắc lại.
3.3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.2.1. Nghiên cứu phương pháp vào mẫu tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và tạo phôi vô tính
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng của 500mg/L Streptomycin đến việc vào mẫu từ mô củ trên sâm Lai Châu.
Công thức 1: ĐC – 0 phút Công thức 2: 5 phút Công thức 3: 10 phút Công thức 4: 15 phút Công thức 5: 20 phút
Phương pháp: Lựa chọn cây sâm Lai Châu không bị sâu bệnh, rửa sạch sơ bộ bộ phận cần sử dụng dưới vòi nước sạch tránh gây tổn thương bề mặt mẫu. Dùng bông cồn 70% lau vệ sinh bề mặt củ, sau đó cắt củ ra thành từng khối vuông phù hợp ngâm trong dung dịch chứa 0,7% thiophanate methyl trong 30 phút. Tiếp theo các khối vuông được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm tiếp trong dung dịch 500mg/L Streptomycin theo các công thức khác nhau (CT1- ĐC: 0 phút; CT2: 5 phút; CT3: 10 phút; CT4: 15 phút; CT5: 20 phút). Rửa lại bằng nước cất vô trùng, rồi xử lý bằng dung dịch sodium hypochlorite 1,5% trong 15 phút. Cuối cùng rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng và để cho ráo nước. Dùng dao loại bỏ hết phần bề mặt xung quanh tiếp xúc với hóa chất khi vô trùng, rồi cắt mẫu thành từng lát mỏng có kích thước 1×5×5mm, và đưa vào môi trường nuôi cấy. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần tương ứng với 5 bình, mỗi bình 5 miếng mẫu. Quan sát và tính tỷ lệ mẫu sạch bệnh, không nhiễm nấm, nhiễm khuẩn đối với 5 công thức khử trùng trên sau 4 tuần nuôi cấy. (Hình 3.2).
Hình 3.2. Ảnh lát cắt mỏng khi vào mẫu từ củ
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng của ethanol 70% đến việc vào mẫu từ mô chồi mầm trên sâm Lai Châu.
CT1-ĐC: 0 phút CT2: 1 phút CT3: 3 phút CT4: 5 phút CT5: 10 phút
Phương pháp: Lựa chọn các chồi mẫu làm vật liệu không bị sâu bệnh, rửa sạch
sơ bộ dưới vòi nước chảy tránh làm tổn thương bề mặt mẫu. Tiến hành cắt nhỏ kích thước các mô cho phù hợp và ngâm trong dung dịch ethyl alcohol 70% theo các công thức khác nhau. Sau đó rửa sạch các mẫu bằng nước cất vô trùng, rồi xử lý bằng 0,7% thiophanate methyl trong 30 phút và dung dịch sodium hypochlorite 1,5% trong 10 phút. Tiếp theo rửa lại mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng rồi để ráo nước. Cắt mẫu thành từng miếng có kích thước 1×5×5mm (Hình 2.10) và đưa vào môi trường nuôi cấy. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần tương ứng với 5 bình, mỗi bình 5 miếng mẫu. Quan sát và tính tỷ lệ mẫu sạch
bệnh, không nhiễm nấm, nhiễm khuẩn đối với 5 công thức khử trùng trên sau 4 tuần nuôi cấy.
Hình 3.3. Ảnh lát cắt mỏng khi vào mẫu sâm Lai Châu từ chồi mầm
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng của Thiophanate methyl 0,7% đến việc vào mẫu từ mô thân trên sâm Lai Châu.
CT1-ĐC: 0 phút CT2: 10 phút CT3: 20 phút CT4: 30 phút CT5: 40 phút
Phương pháp: Đối với mẫu là mô thân: Lựa chọn thân cây không bị sâu bệnh, rửa
sạch sơ bộ dưới vòi nước chảy tránh làm tổn thương bề mặt mẫu. Sau đó dùng bông cồn 70% lau nhẹ nhàng bề mặt mẫu. Bước tiếp theo xử lý mẫu bằng dung dịch 0,7% thiophanate methyl theo các công thức thời gian khác nhau. Tiếp theo, rửa lại mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng và ngâm mẫu 10 phút trong dung dịch 1,5% sodium hypochlorite. Cuối cùng, rửa lại mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng rồi để ráo nước. Cắt mẫu thành từng miếng dài 0,8cm và đưa vào môi trường nuôi cấy. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần tương ứng với 5 bình, mỗi bình 5 miếng mẫu (Hình 3.4). Quan sát và tính tỷ lệ mẫu sạch bệnh, không nhiễm nấm, nhiễm khuẩn đối với 5 công thức thí nghiệm trên sau 4 tuần nuôi cấy.
Hình 3.4. Vào mẫu sâm Lai Châu từ mô thân
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D trong môi trường MS đến cảm ứng tạo mô sẹo
Công thức 1: ĐC – MS
Công thức 2: MS + 0,3 mg/l 2,4-D Công thức 3: MS + 0,5 mg/l 2,4-D Công thức 4: MS + 1 mg/l 2,4-D
Phương pháp: Kế thừa từ thí nghiệm 1, các lát cắt mỏng tế bào mô củ sâm Lai
Châu được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D. Đánh giá, theo dõi và quan sát số lượng mô sẹo trong 5 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và NAA trong môi trường MS đến tỷ lệ tạo thành mô sẹo
Công thức 1: ĐC – MS
Công thức 2: MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 1,0mg/L NAA Công thức 3: MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0mg/L NAA Công thức 4: MS + 1 mg/l 2,4-D + 1,0mg/L NAA
Phương pháp: Đánh giá ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng tạo mô
sẹo ở các loài sâm, các lát cắt mỏng tế bào mô củ được nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy MS cơ bản với dải nồng độ 2,4-D khác nhau (0,3; 0,5; 1,0 mg/L) và kết hợp với NAA (1,0 mg/L) với nồng độ 2,4-D tối ưu để so sánh hiệu quả quá trình tạo mô sẹo. Môi trường MS không có chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng làm đối chứng (ĐC) so sánh. Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần nhắc lại, mỗi lần tương ứng với 5 bình. Đánh giá khả năng cảm ứng tạo mô sẹo sau 2-3 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và 70g/L sucrose trong môi trường MS đến khả năng sinh phôi của mô sẹo.
Công thức 1: ĐC – MS
Công thức 2: MS + 0,05mg/L 2,4-D Công thức 3: MS + 0,1mg/L 2,4-D
Phương pháp: kế thừa mô sẹo được tạo ra từ thí nghiệm trên được cắt thành những mảnh nhỏ kích thước 0,5 x 0,5 cm và nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và 70g/L đường sucrose trong thời gian 7-10 ngày ở điều kiện tối, sau đó chuyển sang điều kiện chiếu sáng 4 tuần. Theo dõi khả năng sinh phôi của mô sẹo sau 3 tháng nuôi cấy.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và TDZ trong môi trường MS có hàm lượng sucrose giảm (30g/L) và nồng độ 1.0 mg/L 2,4-D đến khả năng tạo và nhân phôi vô tính.
Công thức 1: ĐC – MS Công thức 2: MS + 0,5 mg/L NAA + 0.1 mg/L TDZ Công thức 3: MS + 0,5 mg/L NAA + 0.3 mg/L TDZ Công thức 4: MS + 0,5 mg/L NAA + 0.5 mg/L TDZ Công thức 5: MS + 0,5 mg/L NAA + 1 mg/L TDZ Công thức 6: MS + 1 mg/L NAA + 0.1 mg/L TDZ Công thức 7: MS + 1 mg/L NAA + 0.3 mg/L TDZ Công thức 8: MS + 1 mg/L NAA + 0.5 mg/L TDZ Công thức 9: MS + 1 mg/L NAA + 1 mg/L TDZ
Phương pháp: Kế thừa kết quả của thí nghiệm trên, mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được cấy chuyển sang môi trường MS có hàm lượng đường
sucrose giảm (30g/L), 1.0 mg/L 2,4-D và bổ sung đồng thời/riêng rẽ chất điều tiết sinh trưởng NAA và TDZ với dải nồng độ khác nhau. Tiến hành theo dõi và đánh giá thí nghiệm trong vòng từ 8 – 12 tuần.
3.3.2.2 Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường phát sinh hình thái củ micro, rễ, lá mẫu sâm Lai Châu
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nảy mầm phôi soma.
Công thức Nền môi trường Nồng độ NAA (mg/l) Nồng độ BA (mg/l)
Công thức 1 MS 0 0 Công thức 2 0,5 0,5 Công thức 3 0,5 1 Công thức 4 0,5 1,5 Công thức 5 0,5 2 Công thức 6 1 0,5 Công thức 7 1 1 Công thức 8 1 1,5 Công thức 9 1 2
Phương pháp: Các mẫu phôi soma được kế thừa trong các thí nghiệm trên
được sử dụng thực hiện thí nghiệm trên nền môi trường với 9 công thức thí nghiệm. Các chỉ tiêu được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng GA3 so với NAA và BA đến khả năng nảy mầm phôi soma và phát triển thành cây in vitro với củ micro.
Công thức 1: ĐC – MS
Công thức 2: MS + 0,5 mg/l GA3 Công thức 3: MS + 1,0mg/l GA3 Công thức 4: MS + 3,0 mg/l GA3 Công thức 5: MS + 5,0 mg/l GA3
Công thức 6: Công thức tối ưu nhất của thí nghiệm 8
Phương pháp: Phôi soma được kế thừa và nhân ở trong thí nghiệm trên
nghiệm. Tiến hành đánh giá tỷ lệ nảy mầm và phát triển của phôi thành cây con sau 6 tuần nuôi cấy.
3.3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng, lượng than hoạt tính, nồng độ đường đến sinh trưởng và khả năng ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng và môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của cây con với củ micro.
Công thức 1: ĐC : 0 mg/l BA + 1 mg/l NAA Công thức 2: 0,2 mg/l BA + 1 mg/l NAA Công thức 3: 0,5 mg/l BA + 1 mg/l NAA
Phương pháp: Để hoàn thành quy trình nhân giống, cây con có củ micro sau khi
thu được ở các thí nghiệm trước đó tiếp tục chuyển sang môi trường nuôi cấy mới để tiếp tục hoàn thiện thành cây con hoàn chỉnh, có đủ khả năng sống ngoài vườn ươm. Ở giai đoạn tăng trưởng cây con tạo cây hoàn chỉnh, môi trường dinh dưỡng và tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng trong môi trường cũng có những ảnh hưởng tương đối quan trọng. Ở thí nghiệm này, đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA trên 2 môi trường MS và SH đến quá trình tăng trưởng cây con hoàn chỉnh. Cây con thu được ở các thí nghiệm trên sẽ được cấy vào môi trường MS và SH với nồng độ 1 mg/l NAA và các nồng độ BA khác nhau (0,2; 0,5mg/l). Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần nhắc lại, mỗi lần tương ứng với 5 bình (tổng số 25 cây), theo dõi đánh giá sau 90 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính đến sự sinh trưởng và ra rễ của cây in vitro.
CT1: 0 mg/l than hoạt tính (ĐC) CT2: 0,2 mg/l than hoạt tính CT3: 0.5 mg/l than hoạt tính CT4: 1,0 mg/l than hoạt tính
Phương pháp: Sau khi xác định được môi trường tối ưu cho sự phát triển của rễ,
cây con với chiều cao đồng đều 2,5 – 3 cm, đường kính củ 0,3 – 0,4 cm, có lá thật được tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính với nồng độ (0,2; 0,5; 1 mg/l) tới sự sinh trưởng và ra rễ của cây con hoàn chỉnh. Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần nhắc lại, mỗi lần tương ứng với 5 bình (tổng số 25 cây), theo
dõi đánh giá sau 90 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose trên môi trường SH có bổ sung NAA và BA đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro sâm Lai Châu. Công thức 1: ĐC – SH Công thức 2: SH + 2% sucrose Công thức 3: SH + 3% sucrose Công thức 4: SH + 4% sucrose Công thức 5: SH + 5% sucrose Công thức 6: SH + 6% sucrose
Phương pháp: Cây con in vitro thu được kế thừa trong các thí nghiệm trên trong
môi trường SH + NAA + BA có chồi cao 1,0-1,5 cm và củ micro với đường kính 0,3-0,4 cm được cấy chuyển sang môi trường SH có bổ sung đường sucrose với các nồng độ khác nhau theo 5 công thức thí nghiệm. Nồng độ NAA và BA tối ưu được kế thừa từ nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu. Tiến hành theo dõi và đánh giá trong 90 ngày.
Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng cơ bản trong môi trường SH có bổ sung 30g/l sucrose đến sinh trưởng của cây in vitro sâm Lai Châu.
Công thức 1: SH + 0,5 mg/L NAA + 1,0 mg/L BA Công thức 2: 1/2 SH + 0,5 mg/L NAA + 1,0 mg/L BA Công thức 3: 1/3 SH + 0,5 mg/L NAA + 1,0 mg/L BA
Công thức 4: SH + 1,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA + 0,2 g/L than hoạt tính Công thức 5: 1/2 SH + 1,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA + 0,2 g/L than hoạt tính Công thức 6: 1/3 SH + 1,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA + 0,2 g/L than hoạt tính
Phương pháp: Cây con in vitro thu được kế thừa qua các thí nghiệm trên có chồi
cao 1,0-1,5 cm và củ micro với đường kính 0,3-0,4 cm trong môi trường SH có bổ sung NAA và BA với nồng độ tối ưu + 0,2 g/L than hoạt tính tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường mới (SH, 1/2SH, 1/3SH có bổ sung 4% đường sucrose + 0,2 g/L than hoạt tính) với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng tương tự để tạo điều kiện cho cây tiếp tục phát triển hoàn thiện hơn về cấu trúc và có khả năng sống sót ngoài vườn ươm. Theo dõi đánh giá sự sinh trưởng (chiều cao cây)
sau 60 ngày nuôi cấy.
3.3.2.4. Khảo sát khả năng thích ứng của cây giống in vitro ngoài vườn ươm
Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích ứng của cây giống in vitro ngoài vườn ươm.
CT1 (ĐC): Giá thể là 100% đất mùn rừng