Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi cây đến khả năng thích ứng của cây giống in vitro ngoài vườn ươm.
CT1: Cây giống in vitro 1 năm tuổi CT2: Cây giống in vitro 1,5 năm tuổi CT3: Cây giống in vitro 2 năm tuổi
cứu trước đó với độ tuổi từ 1 – 2 năm tuổi. Cây thí nghiệm có sức sống tốt, chiều cao cây ở các độ tuổi đồng đều được trồng trong bầu chứa giá thể dinh dưỡng tốt nhất (Công thức giá thể tốt nhất ở thí nghiệm 14) và đặt trồng trên luống trong vườn ươm với điều kiện môi trường giống nhau. Tổng số cây thí nghiệm: 5 cây/CT: 3 CT x 3 Lần nhắc = 45 cây. Theo dõi đánh giá khả năng sống sót và các chỉ tiêu sinh trưởng (chiều cao cây) sau 60 ngày trồng.
3.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi
3.3.3.1. Các chỉ tiêu theo dõi trong phòng nuôi cấy in vitro
Số lượng mẫu nhiễm (đơn vị mẫu).
Tỷ lệ mẫu nhiễm (đơn vị tính: %) = Tổng số mẫu nhiễm/ Tổng số mẫu cây x 100%.
Tỉ lệ tạo thành mô sẹo (đơn vị tính: %) = (Tổng số mẫu sống/ Tổng số mẫu cây) x 100% và quan sát đặc điểm, trạng thái của mô sẹo.
Kích thước mô sẹo (đơn vị tính cm): đo chiều dài mô
Tỷ lệ phôi vô tính được tạo thành (đơn vị tính: %) = số phôi vô tính/mô sẹo x 100%.
Tỷ lệ phôi nảy mầm thành cây con (đơn vị tính: %) = số phôi nảy mầm thành cây con/tổng số phôi x100% và đặc điểm của cây con in vitro.
Số lượng chồi (đơn vị : số lượng), khối lượng chồi (đơn vị: mg)
Khối lượng cây (g), chiều cao cây (cm), số lượng lá/ cây, số lượng rễ (đơn vị: số lượng), chiều dài rễ (cm).
Đặc điểm sinh trưởng của cây con in vitro: Quan sát đánh giá đặc điểm sinh trưởng của cây.
3.3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi cây giống in vitro ngoài vườn ươm
Tỉ lệ cây sống sót (đơn vị tính %).
Chiều cao cây (cm): Đo từ đầu thân rễ đến lá dài nhất.
Tăng trưởng chiều cao (cm): Chiều cao sau – chiều cao ban đầu.
Đặc điểm sinh trưởng: Quan sát, đánh giá các đặc điểm sinh trưởng của cây.
3.3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các chỉ tiêu tỉ lệ đánh giá được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và IRRISTAT 5.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. GIAI ĐOẠN VÀO MẪU TẠO MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG SINH PHÔI VÀ TẠO PHÔI VÔ TÍNH VÀ TẠO PHÔI VÔ TÍNH
4.1.1. Kết quả nghiên cứu phương pháp vào mẫu từ mô củ, mô chồi mầm và mô thân mô thân
Trong kỹ thuật nuôi cấy in vitro mô thực vật, bước vào mẫu tạo vật liệu vô trùng đóng vai trò rất quan trọng, nó là tiền đề để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo, chẳng hạn như tái sinh trực tiếp hoặc tạo mô sẹo (callus), biệt hóa tế bào mô sẹo thành phôi, chồi, hay rễ. Tuy nhiên, các qui trình vào mẫu tạo vật liệu sạch bệnh không giống nhau, mà nó phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu, cơ quan bộ phận dùng làm mô cấy, cũng như loại hóa chất và cách thức sử dụng khi khử trùng.
Đối với cây tinh dầu và cây dược liệu thì quá trình vào mẫu là tương đối khó khăn, tỷ lệ nhiễm khuẩn và nhiễm nấm nội sinh của mẫu cấy rất cao. Theo nhiều nhà nghiên cứu, cây dược liệu có chứa nhiều hợp chất trao đổi thứ cấp, hợp chất phenolic là nguyên nhân gây khó khăn cho việc vào mẫu. Để vào mẫu thành công cây dược liệu các nhà nghiên cứu đã sử dụng dung dịch 0,2% HgCl2, kháng sinh penicillin, dung dịch sodium hypochlorite, 70% ethanol …để xử lý mẫu theo qui trình riêng(Zhou et al., 2006; Duong Tan Nhut et al., 2012; Zhang et al., 2015).
Trong các loại vật liệu để vào mẫu như củ, chồi mầm, thân lá thì vật liệu củ thường dễ thu thập và bảo quản nhất. Tuy nhiên, củ thường nằm ở trong đất thường rất bẩn và nhiễm một số loại vi khuẩn nội sinh khác nhau nên cần sử dụng thuốc diệt khuẩn streptomycin, cồn để lau mẫu và thiophanate methyl trong 30 phút. Về chồi mầm là phần ở trên mặt đất nên khá sạch sẽ, các mô của chồi mầm thường rất non và rất rễ bị tổn thương nên không thể dùng Streptomycin như với củ được, thay vào đó đề tài sử dụng ethanol 70% để nghiên cứu. Cuối cùng là mô thân cũng là mô non nên không thể sử dụng Streptomycin, mô thân rất dễ bị nhiễm nấm nên tiến hành sử dụng 0,7% thiophanate methyl để nghiên cứu vào mẫu và thử nghiệm.
4.1.1.1. Thí nghiệm 1: Thời gian ảnh hưởng của 500mg/L Streptomycin đến việc vào mẫu từ mô củ trên sâm Lai Châu
Trong nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh từ mô củ, đề tài sử dụng cồn để lau mẫu củ, và dung dịch kháng sinh streptomycin 500 mg/L theo các công thức
thời gian khác nhau (xem mục phương pháp). Theo dõi và quan sát sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả nhận thấy, yếu tố gây nhiễm mẫu mô củ (thân rễ) chủ yếu là do vi khuẩn nội sinh (Hình 4.1). Mẫu không được xử lý bằng streptomycin 500mg/L (CT1-ĐC) bị nhiễm khuẩn từ rất sớm (vào ngày thứ 3 sau cấy), sau đó tăng mạnh và đến ngày thứ 10 các bình đã bị nhiễm khuẩn 100%. Đối với công thức (CT2, CT3, CT4, CT5) vô trùng mẫu còn lại, hiện tượng nhiễm khuẩn xuất hiện muộn hơn vào ngày thứ 7 sau cấy. Hiện tượng nhiễm này tiếp tục gia tăng trong tuần thứ 2 và từ tuần thứ 3 trở đi quan sát không thấy xuất hiện thêm mẫu nhiễm, kết quả này khá tương tự với các kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhật và cs. (2010) trên sâm Ngọc Linh. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1