đã được thu thập
STT Từ giống lúa Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu mẫu nấm phân lập
1 Khang dân 18 Xã Phú Nghĩa KD
2 Nếp 203 Xã Lam Điền N203
3 Nếp Lang Liêu Xã Thụy Hương NLL
4 Q5 Xã Trường Yên Q5
Nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav duy trì tại phòng thí nghiệm bộ môn bệnh cây học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã phân lập được trên các mẫu bệnh đạo ôn ở khu vực Chương Mỹ - Hà Nội.
3.1.2. Các giống lúa
- 12 giống lúa Nhật Bản dùng để xác định mã số chủng sinh lý nấm P. oryzae
STT Tên giống lúa chỉ thị Stt Tên giống lúa chỉ thị
1 Shin 2 7 Yashiromochi
2 Aishi- asahi 8 Pino 4
3 Ishikari- shiroke 9 Toride 1
4 Kanto 51 10 K60
5 Tsuyuake 11 BL1
6 Fukunishiki 12 K59
- Các giống lúa: Khang dân, Q5, nếp Lang liêu, nếp 203, Thiên ưu, TH3-5, Nếp thơm 16, Bắc thơm 7, TBR225 dùng để điều tra theo dõi ngoài đồng ruộng, tiến hành thử nghiệm lây bệnh nhân tạo và thử nghiệm thuốc trong nhà lưới.
3.1.3. Các hoá chất và các nguyên vật liệu khác dùng trong thí nghiệm
Cồn 960, agar, khoai tây, cám gạo, giấy quỳ, kiềm, axit, đường glucose, đường saccarose, …
3.1.4. Thuốc trừ nấm
STT Tên thương mại Hoạt chất Công ty sản xuất
1 Amistar Top 325SC
Azoxystrobin 200g/l Difenoconazole 125g/l
Công ty TNHH Syngenta Việt Nam 2 Hibim 31WP Kasugamycin 2% Tricyclazole 29% Công ty sản phẩm công nghệ cao (HP) 3 Vista 72.5WP Thiophanat-Methyl 35% Tricyclazole 37,5% Công ty cổ phần khử trùng Việt Nam
3.1.5. Các loại môi trường nhân tạo để nuôi cấy và phân lập nấm Pyricularia
oryzae Cav
* Môi trường WA (Nước - Aga): dùng để lấy đơn bào tửnấm P. oryzae
* Môi trường PSA (Khoai tây - đường saccarose - aga): dùng để giữ nấm P. oryzae
* Môi trường PDA (Khoai tây – đường glucose – aga): dùng để nuôi cấy nấm * Môi trường cám – agar: Dùng để nhân nguồn bào tử nấm P. oryzae
*Môi trường PSA nghiêng trong ống nghiệm: dùng để giữ nấm 3.1.6. Các dụng cụ thí nghiệm
Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, panh, kéo, thước đo, bút dạ, đũa thuỷ tinh, lam, lamen, chổi lông, kính hiển vi, kính soi nổi, nồi hấp, tủ sấy, buồng cấy, bình phun, cọc thẻ, giấy thấm, vải lọc ….
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Điều tra thành phần và mức độ phổ biến của một số bệnh chính trên lúa xuân 2016 lúa xuân 2016
3.2.2. Điều tra tình hình bệnh đạo ôn trên lúa xuân 2016
3.2.3. Điều tra ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái, kỹ thuật đến bệnh đạo ôn trên lúa xuân 2016
3.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm của một số mẫu phân lập nấm P. oryzae
- Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm P. oryzae trên một số môi trường; - Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến phát triển của nấm P. oryzae;
3.2.5. Nghiên cứu hiệu lực của một số thuốc trừ nấm đối với nấm P. oryzae
ở trong phòng và đối với bệnh đạo ôn trên lúa 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp điều tra bệnh
* Điều tra tình hình của bệnh: Điều tra theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại lúa năm 2014 (QCVN 01- 166:2014/BNNPTNT).
- Ruộng điều tra: Trên mỗi giống, mỗi loại chân đất, mỗi khu vực khác nhau: lấy 3 ruộng đại diện.
- Điểm điều tra: Mỗi ruộng điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 10 khóm, mỗi khóm 1 dảnh (cây điều tra cách bờ ít nhất 2m).
- Chỉ tiêu điều tra: Điều tra số lá, số bông bị bệnh và phân cấp lá, bông bị bệnh để tính tỷ lệ và chỉ số bệnh.
- Thời gian điều tra:
+ Đối với bệnh đạo ôn lá điều tra giai đoạn lúa đẻ nhánh, đứng cái, làm đòng, và trước khi trỗ.
+ Đối với đạo ôn cổ bông thì điều tra vào giai đoạn lúa chín sáp (sau trỗ 20- 25 ngày).
* Điều tra diễn biến bệnh trên giống nhiễm
- Ruộng điều tra: trên giống TBR225, chọn 3 ruộng đại diện.
- Điểm điều tra: mỗi ruộng điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 10 khóm. mỗi khóm 1 dảnh, cây điều tra đầu tiên cách bờ ít nhất 2 mét.
- Chỉ tiêu điều tra: Điều tra số lá, bông bị bệnh và phân cấp lá, bông bị bệnh để tính chỉ số bệnh, tỷ lệ bệnh.
- Thời gian điều tra: 7 ngày điều tra 1 lần kể từ khi bệnh xuất hiện. * Cấp bệnh trên lá
Đếm toàn bộ số lá và số lá bị bệnh có trong điểm điều tra; phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp:
+ Cấp 0: không có vết bệnh ; + Cấp 1: < 1% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 3: từ 1 - 5% diện tích lá bị bệnh;
+ Cấp 5: > 5 - 25% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 7: > 25 - 50% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 9: > 50 % diện tích lá bị bệnh. * Cấp bệnh trên bông
- Cấp 0: không có vết bệnh ;
- Cấp 1: Vết bệnh có trên một vài gié sơ cấp hoặc nhánh thứ cấp ; - Cấp 3: Vết bệnh có trên một vài gié sơ cấp hoặc phần giữa của trục bông ; - Cấp 5: Vết bệnh bao quanh 1 phần cuống bông hoặc phần ống rạ phía dưới của trục bông ;
- Cấp 7: Vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bông hoạc phần trục bông gần cổ bông, trên bông có 30% số hạt chắc trở lên ;
- Cấp 9: Toàn bộ cổ bông bị bệnh, có số hạt chắc dưới 30% . * Công thức tính toán số liệu
Tổng lá/dảnh bị bệnh - Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng lá/dảnh điều tra (a x b) - Chỉ số bệnh (%) = x 100 N x T a: Số lá/dảnh bị bệnh b: Trị số cấp bệnh tương ứng N: Số lá/dảnh điều tra T: Trị số cấp bệnh cao nhất
* Xử lý số liệu theo chương trình Excel. 3.3.2. Phương pháp thu thập mẫu bệnh
Nhổ cả khóm lúa bị bệnh, đem về trồng trong chậu riêng từng giống, để trong nhà lưới râm mát, dùng nhãn bằng giấy ghi tên giống lúa, ngày lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu rồi buộc vào từng khóm lúa.
3.3.3. Phương pháp phân lập nấm P. oryzae
Sử dụng phương pháp cấy đơn bào tử bằng kim thủy tinh bao gồm các bước sau:
- Lấy mẫu bệnh điển hình từ đồng ruộng; - Rửa sạch mẫu bệnh dưới vòi nước;
- Đặt mẫu trong đĩa petri có giấy lọc ẩm 3 ngày ở 26 - 28oC; - Kiểm tra nấm trên mẫu dưới kính lúp soi nổi;
- Dùng đũa thủy tinh trang bào tử lên đĩa petri có WA úp ngược; - Úp đĩa ngược trên kính hiển vi, dùng kim thủy tinh lấy 1 bào tử;
- Úp ngược đĩa có PSA trên kính hiển vi, chuyển bào tử từ đầu kim thủy tinh vào đĩa;
- Đặt đĩa trong tủ định ôn 26 – 28oC 3 ngày, tản nấm hình thành; - Cấy nấm vào ống nghiệm có PSA nghiêng, giữ ở nhiệt độ 15 – 25oC. 3.3.4. Phương pháp nuôi cấy nấm trên môi trường nhân tạo
Áp dụng phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (1999).
* Chuẩn bị môi trường: Cám-agar, PSA, PDA; môi trường PSA có pH 5, 6, 7 và 8.
- Bước 1: Chuẩn bị đĩa Petri
Đĩa Petri rửa sạch, để khô, sấy ở tủ sấy đến khi nhiệt độ bên trong tủ sấy lên tới 159oC thì tắt điện, đợi sau 1 tiếng thì mới mở tủ ra lấy đĩa.
- Bước 2: Nấu môi trường:
+ Môi trường PSA: 200 gam khoai tây đã gọt vỏ, cắt lát mỏng + 1.000 ml nước cất đun sôi 30 phút sau đó dùng lớp vải màn (4 lớp) lọc lấy nước khoai tây, cho vào 20 gam Sacarose + 20 gam agar vào khuấy cho tan, thêm nước cất cho đủ 1.000 ml, đun sôi.
+ Môi trường cám gạo agar: 20 gam cám gạo + 1.000 ml nước cất, đun sôi 20 phút, lọc bằng vải màn (4 lớp), cho 5 gam glucose, 20 gam agar vào khuấy cho tan, thêm nước cất cho đủ 1.000 ml, đun sôi.
+ Môi trường PDA: tương tự như nấu môi trường PSA, chỉ thay Sacarose bằng đường Glucose.
Pha môi trường có pH 5, 6, 7 và 8 ta dùng dung dịch NaOH hoặc HCl để nhỏ từ từ vào bình tam giác chứa môi trường PSA, lắc đều. Dùng giấy quỳ để thử độ pH và điều chỉnh độ pH thích hợp dựa vào bảng màu (dùng cho thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của nấm trên các môi trường pH khác nhau).
- Bước 3: Hấp khử trùng:
Cho môi trường đã chuẩn bị vào bình tam giác, bịt nút bông vô trùng, bọc nắp bằng giấy bạc, cho vào nồi hấp. Hấp ở 121oC trong 20 phút.
Pha thuốc vào môi trường (dùng cho thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thuốc Amistar top 325SC đến khả năng phát triển của nấm P. oryzae trên môi trường PSA).
+ Dùng bơm tiêm hút 1 ml thuốc hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch A.
+ Lấy 1 ml dung dịch A hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch B. + Lấy 0,5 ml dung dịch B hòa vào 99,5 ml môi trường được nồng độ 0,005%. + Lấy 1 ml dung dịch B hòa và 99 ml môi trường được nồng độ 0,01%. Lắc cho thuốc hòa đều vào môi trường.
- Bước 4: Đổ môi trường:
Chờ cho bình nguội về 40oC, lắc đều rồi đổ ra đĩa petri.
* Chuẩn bị nguồn nấm: Cấy nấm từ ống nghiệm (ống nguồn) vào đĩa petri chứa môi trường PSA (cấy 1 điểm ở chính giữa đĩa) sau 4 - 6 ngày dùng đĩa đó để làm nguồn cấy nấm.
* Cấy nấm lên các môi trường khác nhau: Từ nguồn nấm thuần đã chuẩn bị làm nguồn cấy ở trên, ta dung đột tròn có đường kính 5 mm đột nấm ở đĩa theo đường tròn của đĩa nguồn nấm (để các khoanh nấm có cùng ngày tuổi) sau đó dùng que cấy lấy từng khoanh cấy trên các môi trường đã chuẩn bị (mỗi đĩa cấy 1 khoanh ở chính giữa đĩa petri, mỗi môi trường cấy 3 đĩa).
* Các chỉ tiêu theo dõi
- Sau khi cấy để đĩa nấm và tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC (thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của nấm ở các mức nhiệt độ thì ta đặt nhiệt độ ở các mức 15, 20, 25 và 30oC), đo đường kính của tản nấm sau khi cấy 2, 4, 6, 8 ngày (đối với thí nghiệm khảo sát hiệu lực của thuốc đối đo cả đường kính tản nấm sau 10 ngày
cấy), đo gián tiếp ở phía ngoài đĩa petri, không mở hộp, đo 2 lần theo chiều vuông góc đia qua tâm của đĩa theo hình dấu cộng (+).
* Xử lý số liệu theo chương trình IRRISTAT của Viện nghiên cứu lúa Quốc tế.
3.3.5. Phương pháp đo kích thước bào tử nấm và đếm tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm bào tử nấm
Áp dụng phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (1999).
- Cấy nấm lên đĩa petri chứa môi trường PSA, sau khi cấy 14 ngày, rửa sạch sợi nấm trên bề mặt đĩa petri bằng chổi lông vô trùng và nước cất. Để khô sau đó đặt đĩa vào trong tủ để 12 giờ sáng, 12 giờ tối trong 3 ngày để nấm sinh bào tử. Sau đó dùng 20 ml nước cất có Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho vào 1 hộp petri, lấy 1 giọt dung dịch bào tử nhỏ lên lam đậy lamen lại đưa lên kính hiển vi quan sát.
- Đo kích thước bào tử nấm: dùng thước đo kính hiển vi quang học, thước có 10 vạch lớn, mỗi vạch lớn có 10 vạch nhỏ như vậy tổng có 100 vạch nhỏ. Đo ở vật kính 40, mỗi vạch nhỏ của thước bằng 2,5 µm. Đếm số vạch rồi nhân lên với 2,5 là ra kích thước cần đo. Mỗi mẫu phân lập đo 30 bào tử.
- Đếm tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm: Mầm dài bằng 2/3 độ dài bào tử thì được tính là nảy mầm (theo Plant Phytopathology), đếm 5 quang trường, mỗi quang trường 15 – 20 bảo tử.
- Xử lý số liệu theo chương trình Excel. 3.3.6. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
* Chuẩn bị cây mạ
- Ngâm hạt lúa giống cho này mầm, đem gieo vào các khay nhựa có bùn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống gieo 2 hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau đó chờ vài ngày cho cây bám rễ và mọc thành cây tăm ta đem ngâm vào bể, hoặc chú ý tưới nước, chăm sóc cho cây phát triển bình thường. Sau khi gieo 20-22 ngày (cây có khoảng 4 lá thật) thì phun dung dịch bào tử để lây bệnh.
* Chuẩn bị nguồn bào tử để lây nhiễm
- Lấy nấm từ ống nghiệm lưu giữ nguồn đã phân lập cấy lên đĩa petri chứa môi trường PSA, mỗi mẫu phân lập cấy 2 đĩa, mỗi đĩa cấy 3 điểm sau đó đặt đĩa đã cấy vào tử định ôn 28oC sau 2 tuần, lúc này sợi nấm sẽ mọc kín môi trường.
- Lấy đĩa nấm ra khỏi tủ, dùng bình tia phun nước cất vào, dùng chổi lông quét đi, quét lại nhiều lần trên bề mặt đĩa, dùng bình tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước quét khô mặt thạch (mỗi mẫu phân lập dùng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sôi).
- Đặt đĩa nấm trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối sau 3 ngày để bào tử hình thành. Dùng 20ml nước vô trùng có pha Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho một đĩa petri. Lấy 1 giọt dung dịch bào tử đã rửa ở trên nhỏ lên lam kính soi dưới kính hiển vi. Đếm số bào tử trên quang trường 10X. Điều chỉnh dung dịch bào tử sao cho có khoảng 30-50 bào tử trên quang trường tương đương với 105 bào tử/ml, đếm 5 quang trường 10X.
* Lây nhiễm
Sử dụng bình phun cầm tay loại dung tích 0,5 lít để phung dung dịch lên lúa, phun ướt đều các lá lúa. Sau đó đặt khay lúa trong tủ lây nhiễm, phun và giữ ẩm liên tục trong 20 giờ (ẩm trên 90%), sau đó đem lúa đã lây nhiễm ra khỏi tủ ẩm đặt dưới ánh sáng tán xạ, tưới nước đầy đủ để lúa vẫn tiếp tục phát triển.
* Đánh giá
Quan sát thời gian (ngày) kể từ khi lây nhiễm tới khi xuất hiện vết bệnh đầu tiên.
Sau 7 ngày lây nhiễm tiến hành đánh giá phản ứng của các giống lúa theo thang phân cấp của Kato, 1993.
Cấp 0: không có vết bệnh, kháng cao (HR)
Cấp 1: vết bệnh là một chấm nhỏ bằng đầu kim, kháng (R) Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nâu nhạt đến nâu tối, kháng (MR) Cấp 3: Vết bệnh to hơn màu xám ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
Cấp 4: Vết bệnh điển hình (hình thoi có màu xám ở giữa), nhiễm nặng (HS)
Cấp 0, 1, 2: kháng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh
3.3.7. Phương pháp xác định mã số chủng sinh lý nấm P. oryzae
Sau khi lây bệnh nhân tạo trên 12 giống lúa Nhật Bản, các giống có mức
nhiễm S được dùng để tính mã số chủng sinh lý nấm P. oryzae bằng cách hàng
trăm cộng với nhau, hàng chục cộng với nhau, hàng đơn vị cộng với nhau và hàng thập phân cộng với nhau.
3.3.8. Phương pháp xác định hiệu lực của thuốc
3.3.8.1. Phương pháp xác định hiệu lực của thuốc Amistar top 325 SC trong phòng thí nghiệm
CT1: Thuốc Amistar top 325SC nồng độ 0.01%; CT2: Thuốc Amistar top 325SC nồng độ 0.005%; CT3: Đối chứng (dùng nước cất vô trùng).
Tiến hành nhắc lại 3 lần với mỗi công thức. Quan sát hiệu lực của thuốc ở các nồng độ khác nhau và đưa ra kết luận.
Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính tản nấm trong vòng 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau cấy của các công thức.
Hiệu lực ức chế thuốc trong phòng thí nghiệm được tính theo công thức Abbott: C - T
HLĐK (%) = --- x 100 C
Trong đó: C: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng ;
T: đường kính tản nấm ở công thức có xử lý thuốc.
3.3.8.2. Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc Amistar top 325 SC trong nhà lưới
- Gieo giống Q5 trên khay nhựa (cách ngâm ủ mạ tương tự phương pháp lây