Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.15.Chọn tạo giống kháng bền bệnh đạo ôn
Nhiều nước đang thực hiện chương trình chọn tạo giống lúa kháng bền bệnh đạo ôn. Từ năm 1904 các nhà chọn giống Nhật Bản tạo được một số giống thương mại có tính kháng đồng ruộng sử dụng trong nhiều năm. Tuy nhiên những giống này mất dần tính kháng, nguyên nhân là do xuất hiện những nòi mới (Ezuka, 1979; Rosero, 1979). Chọn tạo giống kháng bền khó khăn vì tính kháng luôn đối kháng với các đặc điểm nông học như năng suất, phẩm chất hạt (Ezuka, 1979). Trong quá trình lai tạo, thế hệ lai không nhận được toàn bộ gen kháng từ bố mẹ. Giống Sensho và Tẻ Tép kháng bền, nhưng các giống chọn ra từ các tổ hợp lai của chúng không duy trì được tính kháng như vậy (Ou, 1985). Phương pháp giống nhiều dòng, nhiều giống kháng dọc luân phiên nhau trên thực tế không có hiệu quả (Ikehashi and Khush, 1979).
Ou (1979) đề xuất lý thuyết tính kháng bền đạo ôn của lúa. Lý thuyết này dựa vào tính đa dạng của thành phần nòi nấm. Một giống lúa tích lũy càng nhiều gen kháng, khả năng kháng bệnh càng cao, nhà chọn giống cần lai nhiều tổ hợp với bố mẹ có tính kháng cao và chỉ chọn những dòng có ít vết bệnh. Teng (1993) đề xuất sử dụng gen Pyramid, hai hay nhiều gen lớn tích lũy vào một giống cải tiến.
* Zeigler (1993) đề xuất giả thuyết “loại trừ dòng” để phát triển giống kháng bền:
1. Quần thể nấm đạo ôn bao gồm những dòng vô tính có tổ tiên chung; 2. Từng dòng vô tính có phổ độc riêng;
3. Một giống được tích lũy bởi một số gen kháng có thể kháng với mọi dòng vô tính của quần thể.
* Zeigler (1993) cũng đề xuất trình tự tạo giống kháng bền bệnh đạo ôn: 1. Xác định thành phần dòng của quần thể nấm và phổ độc tương ứng của chúng;
2. Tìm và tách gen kháng theo mục đích chọn tạo giống;
3. Xác định đặc điểm gen kháng để có hiệu quả cho “loại trừ dòng”; 4. Gom gen kháng vào giống cải tiến sử dụng cho từng vùng sinh thái; 5. Nắm bắt đầy đủ cơ sở kháng bệnh của giống;
Với phương tiện sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể phân tích thành phần dòng của nấm P. grisea, gen kháng ở giống lúa và triển vọng có thể chọn tạo được giống kháng bền theo ý muốn (Zeigler, 1993).
Theo Nguyễn Thị Phong Lan và cs. (2015), độc tính của nguồn nấn P. grisea gây bệnh đạo ôn lúa có biến động giữa các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Một số gen kháng còn hiệu lực cao ở ĐBSCL là Pik-s (IRBLksf-S), Pik-p, Pik-h, Pi9(s)(IRBL9-W), Pish (IRBLsh-S), Pii, Piz-5, Pita (IRBLta-K1) có thể sử dụng trong các chương trình lai tạo giống kháng bệnh cho vùng ĐBSCL. 2.16. VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG NẤM ĐẠO ÔN
Lê Như Kiều và cs. (2007) đã phân lập và thu thập được 60 isolates mẫu nấm gây bệnh đạo ôn trên 26 giống lúa khác nhau ở các tỉnh Hà Nam, Thái Bình, Hưng Yên, Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình và Phú Yên. Bước đầu tuyển chọn được 4 chủng vi khuẩn (RH1, RH6, RH8 và RH13) phân lập từ rễ hành có khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng của nấm P. oryzae gây bệnh đạo ôn.
Tại ĐBSCL các chủng sinh lý cho hiệu quả cao trong phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng bao gồm Bacillus amyloliquefacien strain 26, Streptomyces viriabilis strain 28, Streptomyces fulvissimus strain 30 là nguồn tác nhân tiềm năng nguồn vi sinh vật bản địa quý cần được nhân rộng trong sản xuất (Nguyễn Thị Phong Lan và cs., 2015).
2.17. PHÒNG TRỪ BỆNH ĐẠO ÔN
Theo Nguyễn Văn Viên và cs. (2013), nấm đạo ôn có nhiều hình thức bảo tồn trong tự nhiên: Bằng sợi nấm và bào tử ở hạt giống, rơm rạ, cỏ dại, lúa chét sau gặt, truyền lan bệnh bằng nhiều con đường khác nhau. Vì vậy phòng ngừa và khống chế bệnh hại cần thiết phải áp dụng đồng bộ một hệ thống các biện pháp tổng hợp trong đó bao gồm các biện pháp kỹ thuật trồng trọt, sử dụng giống kháng bệnh cơ cấu giống theo mùa vụ thích hợp kết hợp với các biện pháp hóa học và vệ sinh đồng ruộng nhằm chủ động phòng ngừa bệnh và ngăn chặn sự phát triển bệnh thành dịch, đảm bảo được năng suất ổn định của giống lúa gieo trồng.
Theo Nguyễn Thị Phong Lan và cs. (2015), áp dụng mô hình ứng dụng quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh đạo ôn hại lúa giúp giảm 82.45% tỷ lệ
bệnh, 89,9% chỉ số bệnh đạo ôn lá và 79,55% tỷ lệ bệnh đạo ôn cổ bông, tiết kiệm chi phí và tăng hiệu quả đầu tư 39,12% tại vụ Đông Xuân 2014-2015 ở vùng ĐBSCL.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav
Nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav. được thu thập từ các mẫu bệnh đạo ôn ngoài đồng ruộng trên các giống lúa thuộc khu vực huyện Chương Mỹ - Hà Nội. Các mẫu thu thập được bảo quản tươi đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập bằng phương pháp cấy đơn bào tử. Các mẫu sau khi phân lập được sử dụng để làm nguồn nghiên cứu.
Bảng 3.1. Nguồn mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav. đã được thu thập đã được thu thập
STT Từ giống lúa Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu mẫu nấm phân lập
1 Khang dân 18 Xã Phú Nghĩa KD
2 Nếp 203 Xã Lam Điền N203
3 Nếp Lang Liêu Xã Thụy Hương NLL
4 Q5 Xã Trường Yên Q5
Nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav duy trì tại phòng thí nghiệm bộ môn bệnh cây học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã phân lập được trên các mẫu bệnh đạo ôn ở khu vực Chương Mỹ - Hà Nội.
3.1.2. Các giống lúa
- 12 giống lúa Nhật Bản dùng để xác định mã số chủng sinh lý nấm P. oryzae
STT Tên giống lúa chỉ thị Stt Tên giống lúa chỉ thị
1 Shin 2 7 Yashiromochi
2 Aishi- asahi 8 Pino 4
3 Ishikari- shiroke 9 Toride 1
4 Kanto 51 10 K60
5 Tsuyuake 11 BL1
6 Fukunishiki 12 K59
- Các giống lúa: Khang dân, Q5, nếp Lang liêu, nếp 203, Thiên ưu, TH3-5, Nếp thơm 16, Bắc thơm 7, TBR225 dùng để điều tra theo dõi ngoài đồng ruộng, tiến hành thử nghiệm lây bệnh nhân tạo và thử nghiệm thuốc trong nhà lưới.
3.1.3. Các hoá chất và các nguyên vật liệu khác dùng trong thí nghiệm
Cồn 960, agar, khoai tây, cám gạo, giấy quỳ, kiềm, axit, đường glucose, đường saccarose, …
3.1.4. Thuốc trừ nấm
STT Tên thương mại Hoạt chất Công ty sản xuất
1 Amistar Top 325SC
Azoxystrobin 200g/l Difenoconazole 125g/l
Công ty TNHH Syngenta Việt Nam 2 Hibim 31WP Kasugamycin 2% Tricyclazole 29% Công ty sản phẩm công nghệ cao (HP) 3 Vista 72.5WP Thiophanat-Methyl 35% Tricyclazole 37,5% Công ty cổ phần khử trùng Việt Nam
3.1.5. Các loại môi trường nhân tạo để nuôi cấy và phân lập nấm Pyricularia
oryzae Cav
* Môi trường WA (Nước - Aga): dùng để lấy đơn bào tửnấm P. oryzae
* Môi trường PSA (Khoai tây - đường saccarose - aga): dùng để giữ nấm P. oryzae
* Môi trường PDA (Khoai tây – đường glucose – aga): dùng để nuôi cấy nấm * Môi trường cám – agar: Dùng để nhân nguồn bào tử nấm P. oryzae
*Môi trường PSA nghiêng trong ống nghiệm: dùng để giữ nấm 3.1.6. Các dụng cụ thí nghiệm
Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, panh, kéo, thước đo, bút dạ, đũa thuỷ tinh, lam, lamen, chổi lông, kính hiển vi, kính soi nổi, nồi hấp, tủ sấy, buồng cấy, bình phun, cọc thẻ, giấy thấm, vải lọc ….
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Điều tra thành phần và mức độ phổ biến của một số bệnh chính trên lúa xuân 2016 lúa xuân 2016
3.2.2. Điều tra tình hình bệnh đạo ôn trên lúa xuân 2016
3.2.3. Điều tra ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái, kỹ thuật đến bệnh đạo ôn trên lúa xuân 2016
3.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm của một số mẫu phân lập nấm P. oryzae
- Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm P. oryzae trên một số môi trường; - Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến phát triển của nấm P. oryzae;
3.2.5. Nghiên cứu hiệu lực của một số thuốc trừ nấm đối với nấm P. oryzae
ở trong phòng và đối với bệnh đạo ôn trên lúa 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp điều tra bệnh
* Điều tra tình hình của bệnh: Điều tra theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại lúa năm 2014 (QCVN 01- 166:2014/BNNPTNT).
- Ruộng điều tra: Trên mỗi giống, mỗi loại chân đất, mỗi khu vực khác nhau: lấy 3 ruộng đại diện.
- Điểm điều tra: Mỗi ruộng điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 10 khóm, mỗi khóm 1 dảnh (cây điều tra cách bờ ít nhất 2m).
- Chỉ tiêu điều tra: Điều tra số lá, số bông bị bệnh và phân cấp lá, bông bị bệnh để tính tỷ lệ và chỉ số bệnh.
- Thời gian điều tra:
+ Đối với bệnh đạo ôn lá điều tra giai đoạn lúa đẻ nhánh, đứng cái, làm đòng, và trước khi trỗ.
+ Đối với đạo ôn cổ bông thì điều tra vào giai đoạn lúa chín sáp (sau trỗ 20- 25 ngày).
* Điều tra diễn biến bệnh trên giống nhiễm
- Ruộng điều tra: trên giống TBR225, chọn 3 ruộng đại diện.
- Điểm điều tra: mỗi ruộng điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 10 khóm. mỗi khóm 1 dảnh, cây điều tra đầu tiên cách bờ ít nhất 2 mét.
- Chỉ tiêu điều tra: Điều tra số lá, bông bị bệnh và phân cấp lá, bông bị bệnh để tính chỉ số bệnh, tỷ lệ bệnh.
- Thời gian điều tra: 7 ngày điều tra 1 lần kể từ khi bệnh xuất hiện. * Cấp bệnh trên lá
Đếm toàn bộ số lá và số lá bị bệnh có trong điểm điều tra; phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp:
+ Cấp 0: không có vết bệnh ; + Cấp 1: < 1% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 3: từ 1 - 5% diện tích lá bị bệnh;
+ Cấp 5: > 5 - 25% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 7: > 25 - 50% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 9: > 50 % diện tích lá bị bệnh. * Cấp bệnh trên bông
- Cấp 0: không có vết bệnh ;
- Cấp 1: Vết bệnh có trên một vài gié sơ cấp hoặc nhánh thứ cấp ; - Cấp 3: Vết bệnh có trên một vài gié sơ cấp hoặc phần giữa của trục bông ; - Cấp 5: Vết bệnh bao quanh 1 phần cuống bông hoặc phần ống rạ phía dưới của trục bông ;
- Cấp 7: Vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bông hoạc phần trục bông gần cổ bông, trên bông có 30% số hạt chắc trở lên ;
- Cấp 9: Toàn bộ cổ bông bị bệnh, có số hạt chắc dưới 30% . * Công thức tính toán số liệu
Tổng lá/dảnh bị bệnh - Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng lá/dảnh điều tra (a x b) - Chỉ số bệnh (%) = x 100 N x T a: Số lá/dảnh bị bệnh b: Trị số cấp bệnh tương ứng N: Số lá/dảnh điều tra T: Trị số cấp bệnh cao nhất
* Xử lý số liệu theo chương trình Excel. 3.3.2. Phương pháp thu thập mẫu bệnh
Nhổ cả khóm lúa bị bệnh, đem về trồng trong chậu riêng từng giống, để trong nhà lưới râm mát, dùng nhãn bằng giấy ghi tên giống lúa, ngày lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu rồi buộc vào từng khóm lúa.
3.3.3. Phương pháp phân lập nấm P. oryzae
Sử dụng phương pháp cấy đơn bào tử bằng kim thủy tinh bao gồm các bước sau:
- Lấy mẫu bệnh điển hình từ đồng ruộng; - Rửa sạch mẫu bệnh dưới vòi nước;
- Đặt mẫu trong đĩa petri có giấy lọc ẩm 3 ngày ở 26 - 28oC; - Kiểm tra nấm trên mẫu dưới kính lúp soi nổi;
- Dùng đũa thủy tinh trang bào tử lên đĩa petri có WA úp ngược; - Úp đĩa ngược trên kính hiển vi, dùng kim thủy tinh lấy 1 bào tử;
- Úp ngược đĩa có PSA trên kính hiển vi, chuyển bào tử từ đầu kim thủy tinh vào đĩa;
- Đặt đĩa trong tủ định ôn 26 – 28oC 3 ngày, tản nấm hình thành; - Cấy nấm vào ống nghiệm có PSA nghiêng, giữ ở nhiệt độ 15 – 25oC. 3.3.4. Phương pháp nuôi cấy nấm trên môi trường nhân tạo
Áp dụng phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (1999).
* Chuẩn bị môi trường: Cám-agar, PSA, PDA; môi trường PSA có pH 5, 6, 7 và 8.
- Bước 1: Chuẩn bị đĩa Petri
Đĩa Petri rửa sạch, để khô, sấy ở tủ sấy đến khi nhiệt độ bên trong tủ sấy lên tới 159oC thì tắt điện, đợi sau 1 tiếng thì mới mở tủ ra lấy đĩa.
- Bước 2: Nấu môi trường:
+ Môi trường PSA: 200 gam khoai tây đã gọt vỏ, cắt lát mỏng + 1.000 ml nước cất đun sôi 30 phút sau đó dùng lớp vải màn (4 lớp) lọc lấy nước khoai tây, cho vào 20 gam Sacarose + 20 gam agar vào khuấy cho tan, thêm nước cất cho đủ 1.000 ml, đun sôi.
+ Môi trường cám gạo agar: 20 gam cám gạo + 1.000 ml nước cất, đun sôi 20 phút, lọc bằng vải màn (4 lớp), cho 5 gam glucose, 20 gam agar vào khuấy cho tan, thêm nước cất cho đủ 1.000 ml, đun sôi.
+ Môi trường PDA: tương tự như nấu môi trường PSA, chỉ thay Sacarose bằng đường Glucose.
Pha môi trường có pH 5, 6, 7 và 8 ta dùng dung dịch NaOH hoặc HCl để nhỏ từ từ vào bình tam giác chứa môi trường PSA, lắc đều. Dùng giấy quỳ để thử độ pH và điều chỉnh độ pH thích hợp dựa vào bảng màu (dùng cho thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của nấm trên các môi trường pH khác nhau).
- Bước 3: Hấp khử trùng:
Cho môi trường đã chuẩn bị vào bình tam giác, bịt nút bông vô trùng, bọc nắp bằng giấy bạc, cho vào nồi hấp. Hấp ở 121oC trong 20 phút.
Pha thuốc vào môi trường (dùng cho thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thuốc Amistar top 325SC đến khả năng phát triển của nấm P. oryzae trên môi trường PSA).
+ Dùng bơm tiêm hút 1 ml thuốc hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch A.
+ Lấy 1 ml dung dịch A hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch B. + Lấy 0,5 ml dung dịch B hòa vào 99,5 ml môi trường được nồng độ 0,005%. + Lấy 1 ml dung dịch B hòa và 99 ml môi trường được nồng độ 0,01%. Lắc cho thuốc hòa đều vào môi trường.
- Bước 4: Đổ môi trường:
Chờ cho bình nguội về 40oC, lắc đều rồi đổ ra đĩa petri.
* Chuẩn bị nguồn nấm: Cấy nấm từ ống nghiệm (ống nguồn) vào đĩa petri chứa môi trường PSA (cấy 1 điểm ở chính giữa đĩa) sau 4 - 6 ngày dùng đĩa đó để làm nguồn cấy nấm.
* Cấy nấm lên các môi trường khác nhau: Từ nguồn nấm thuần đã chuẩn bị làm nguồn cấy ở trên, ta dung đột tròn có đường kính 5 mm đột nấm ở đĩa theo đường tròn của đĩa nguồn nấm (để các khoanh nấm có cùng ngày tuổi) sau đó dùng que cấy lấy từng khoanh cấy trên các môi trường đã chuẩn bị (mỗi đĩa cấy 1 khoanh ở chính giữa đĩa petri, mỗi môi trường cấy 3 đĩa).
* Các chỉ tiêu theo dõi
- Sau khi cấy để đĩa nấm và tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC (thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của nấm ở các mức nhiệt độ thì ta đặt nhiệt độ ở các mức 15, 20, 25 và 30oC), đo đường kính của tản nấm sau khi cấy 2, 4, 6, 8 ngày (đối với thí nghiệm khảo sát hiệu lực của thuốc đối đo cả đường kính tản nấm sau 10 ngày
cấy), đo gián tiếp ở phía ngoài đĩa petri, không mở hộp, đo 2 lần theo chiều vuông góc đia qua tâm của đĩa theo hình dấu cộng (+).
* Xử lý số liệu theo chương trình IRRISTAT của Viện nghiên cứu lúa Quốc tế.
3.3.5. Phương pháp đo kích thước bào tử nấm và đếm tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm bào tử nấm
Áp dụng phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật