Theo Ou (1985) thì dùng bột bào tử khô để lây nhiễm lên lá lúa. Zeigler (1993) đặt môi trường thạch nước có thấm bào tử nấm lên lá lúa. Theo phương pháp này có thể lây 2 hoặc nhiều mẫu bệnh trên cùng một lá.
Phổ biến và tiện lợi hơn cả là phun dung dịch bào tử lên cây lúa (Ou, 1985). Nồng độ dung dịch bào tử không chỉ ảnh hưởng đến số lượng vết bệnh, mà cả
kiểu vết bệnh. Nồng độ dung dịch thường là 50.000 - 150.000 bào tử/ml (Torres, 1986). Có thể dùng dung dịch thật loãng để lây nhiễm. Vì khi ấy các vết bệnh trên lá sẽ thưa thớt, không dính liền nhau.
Các mẫu bệnh có thể bảo quản bằng nhân truyền nhiều lần trong ống nghiệm. Phương pháp này có thể giảm độc tính. Có thể duy trì bảo quản nấm ở hạt cao lương hoặc giấy thấm và cất giữ ở kho lạnh 6oC (Bonman et al., 1986). 2.11.6. Kiểu vết bệnh
Theo Ou (1985), kiểu vết bệnh là một trong những đặc điểm được sử dụng để đánh giá tính kháng bệnh của giống. Ở từng cây và ở ngay trên một lá lúa có thể gặp nhiều kiểu vết bệnh khác nhau. Kiểu vết bệnh là một trong những đặc điểm được sử dụng để đánh giá tính kháng bệnh của giống. Kích thước, hình dạng và màu sắc vết bệnh ở đốt thân, cổ bông và trên hạt thường không rõ rệt như trên lá. Người ta căn cứ vào kích thước, hình dạng và màu sắc vết bệnh mà phân chia kiểu vết bệnh. Có nhiều bảng phân cấp kiểu vết bệnh. Hệ thống phân chia kiểu vết bệnh hiện đang được sử dụng khá phổ biến là: kiểu 0 – không vết bệnh; kiểu 1 – vết bệnh như đầu kim, không có bào tử; kiểu 3 – vết bệnh từ hình tròn đến hơi dài, đường kính 1 - 2 mm có đường viền màu nâu và quang vàng, sinh sản bào tử; kiểu 5 – vết bệnh hình chíp, kích thước 1 - 2 x 3 mm có đường viền màu nâu; kiểu 7 – vết bệnh hình lưỡi kiếm, có đường viền màu nâu hoặc đỏ tía; kiểu 9 – vết bệnh cấp tính màu trắng nhạt, xám nhạt, không có đường viền rõ rệt, phát triển nhanh. Các vết bệnh 5, 7, 9 là kiểu nhiễm, các kiểu còn lại là kiểu kháng. Đánh giá mức kháng nhiễm của giống là căn cứ vào kiểu vết bệnh nào chiếm trên 60% số vết bệnh trên cây.
2.11.7. Các bảng phân cấp đánh giá tính kháng bệnh
Căn cứ vào kiểu hình vết bệnh, màu sắc, số lượng vết bệnh và độ còi cọc, thấp lùn của cây lúa, nhiều nhà khoa học đã thành lập những bảng phân cấp bệnh
khác nhau. Có những bảng phân cấp bệnh của ATKina (1975), Fernando et al.,
(1961), Ou (1961, 1965); Bonman (1986), Torres (1986) (dẫn theo Ou, 1985). Hiện nay những bảng phân cấp sau đây về bệnh đạo ôn được coi là hoàn chỉnh nhất:
1. Bảng phân 5 cấp đánh giá đạo ôn lá trong lây nhiễm nhân tạo ở nhà kính (Ou, 1979).
2. Bảng phân 9 cấp đánh giá đạo ôn lá ở nương mạ đạo ôn hay trên đồng ruộng (Ou, 1979).
3. Bảng phân 7 cấp đạo ôn cổ lá (Torres, 1986). 4. Bảng phân 7 cấp đạo ôn đốt thân (Torres, 1986).
5. Bảng phân 9 cấp đánh giá đạo ôn cổ bông dựa vào triệu chứng bệnh (IRRI, 1988).
6. Bảng phân 9 cấp đánh giá đạo ôn cổ bông dựa vào tỷ lệ bông bị nhiễm bệnh cấp 7, 9 (Ou, 1979).
Tồn tại cả 2 bảng phân cấp đánh giá đạo ôn lá bởi vì diện tích bệnh trên lá ở thí nghiệm nhà kính ít hơn so với ở thí nghiệm nương mạ hay ở đồng ruộng. Chưa có những nghiên cứu về tương quan giữa đạo ôn lá, đạo ôn tai lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông (Torres, 1986).
Căn cứ vào phản ứng của các mẫu bệnh lây nhiễm lên 5 giống lúa có đơn gen kháng khác nhau Zeigler (1993) đã thành lập bảng phân cấp 32 dạng độc. 2.12. CƠ CHẾ CỦA TÍNH KHÁNG BỆNH
Theo Ou (1985) thì Otani (1952) và Tokunaga (1966), tìm thấy tỷ số giữa đạm hòa tan và đạm tổng số tương quan chặt với tính mẫn cảm, còn hydrat cacbon thì ngược lại. Hàm lượng silicagen nằm xen kẽ với lớp xenlulo trong biểu bì mô cây có tác dụng bảo vệ, chống sự xâm hại của nấm. Nhưng cũng có những giống hàm lượng silic cao lại cảm bệnh chứng tỏ bản chất tính kháng không phải chỉ do cơ chế bảo vệ cơ giới đơn thuần. Các mô cây bị mất nước hoặc giảm sức trương cũng giảm tính kháng. Tinh bột tích lũy càng nhiều, càng làm tăng tính kháng. Giải thích điều này có thể là do nấm đạo ôn phân hủy tinh bột yếu (Ou, 1985). Các giống kháng tiết ra axit clorogenic và axit ferulic có tác dụng giải độc axit α – picolinlic và Piricularin do nấm tiết ra. Các giống kháng cũng nhạy cảm với tác động ức chế của Piricularin tạo nhiều phenol như Octhodihydroxyphenol làm vết bệnh có màu nâu. Các giống kháng cũng có phản ứng “siêu nhạy” cô lập và làm mất khả năng lan truyền của nấm (Ou, 1985). Cơ chế kháng bị động và chủ động trên đây chưa giải thích được tại sao giống kháng được nòi nấm này lại mẫn cảm với nòi nấm khác. Cơ chế di truyền mới giải thích được hiện tượng trên. 2.13. DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG ĐẠO ÔN CỦA LÚA
Để nghiên cứu mối quan hệ giữa các gen kháng, phương pháp chuyển dịch lẫn nhau giữa các nhiễm sắc thể (chromosome reciprocal translocstion method)
đã được sử dụng. Trong bản đồ về mối quan hệ giữa các gen, các gen Pi-i, Pi-z, Pi-zt và Pi-z(t) ở nhóm liên kết wx; Pi-a, Pi-f, Pi-k, Pi-ks, Pi-kh, Pi-kpPi-m, Pi-1(t) ở nhóm La; Pi-ta, Pi- ta2 ở fs; Pi-b ở nhóm RL. Nhóm wx ở nhiễm sắc thể thứ 6, La ở nhiễm sắc thể thứ 9, fs ở nhiễm sắc thể thứ 1. Các gen Pi-k, Pi-ks, Pi-kp alen với nhau và cùng nằm trên locus Pi-k (Ezuka, 1979; Inukai, 1993).
Sử dụng các isolate nấm lây nhiễm lên các giống bố, mẹ, F1, F2, F3, backcross 1 và kết luận rằng khi lây nhiễm bằng isolate này, có thể xác định được một gen kháng, với isolate khác có thể là là 2 hoặc nhiều hơn.
Nhiều gen nhỏ (r) điều khiển tính kháng ngang. Giống Norin mochi 4 có 3 gen nhỏ. Có thể trong một giống kháng ngang có cả gen nhỏ và gen lớn (Ou, 1979). Có thể có hai hay nhiều gen điều khiển tính kháng ngang đạo ôn cổ bông (Padmanabhan, 1979). Chưa có nhiều tài liệu về cấu trúc vi mô của gen kháng đạo ôn.
Hiện nay do sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, những phương pháp mới ra đời có thể cho phép gom gen kháng đạo ôn từ một số giống vào giống lúa cải tiến (Khush, 1987). Viện nghiên cứu lúa quốc tế đang thực hiện ý đồ trên (Zeigler, 1993).
2.14. MỐI QUAN HỆ GIỮA LÚA VÀ NẤM Pyricularia oryzae Cav
Flor (1956) giải thích mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ của thuyết “gen đối gen” khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt ở cây lanh. Kiyosawa (1981) xác nhận thuyết trên có thể áp dụng có mối quan hệ giữa nấm P. grisea và lúa. Thuyết Flor cho rằng đối với mỗi gen kháng của cây ký chủ lại có một gen gây bệnh tương ứng của ký sinh. Sự xuất hiện phổ biến những gen kháng mới ở ký chủ sẽ làm thay đổi quần thể ký sinh. Qua chọn lọc những cá thể có gen mới gây bệnh (Van der Plank, 1978). Trên cơ sở lý thuyết “gen đối gen”, Takahashi (1965) đề xuất giả thuyết được mô hình hóa như sau: chẳng hạn có 4 giống lúa là I kháng bệnh đạo ôn tốt nhất có 4 cửa A, B, C, D được đóng bởi 4 gen kháng (mỗi gen giữ một cửa). Giống II kháng trung bình có 2 cửa A, C. Giống III có 2 cửa B, D. Giống IV chỉ có 1 cửa A. Một nòi nấm chỉ có 1 chìa khóa (gen độc tính) mở cửa A sẽ có thể chỉ gây bệnh cho giống IV. Một nòi khác có 2 khóa mở được 2 cửa A và C và có thể gây bệnh cho các giống II và IV (Ou, 1985).
2.15. CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG BỀN BỆNH ĐẠO ÔN
Nhiều nước đang thực hiện chương trình chọn tạo giống lúa kháng bền bệnh đạo ôn. Từ năm 1904 các nhà chọn giống Nhật Bản tạo được một số giống thương mại có tính kháng đồng ruộng sử dụng trong nhiều năm. Tuy nhiên những giống này mất dần tính kháng, nguyên nhân là do xuất hiện những nòi mới (Ezuka, 1979; Rosero, 1979). Chọn tạo giống kháng bền khó khăn vì tính kháng luôn đối kháng với các đặc điểm nông học như năng suất, phẩm chất hạt (Ezuka, 1979). Trong quá trình lai tạo, thế hệ lai không nhận được toàn bộ gen kháng từ bố mẹ. Giống Sensho và Tẻ Tép kháng bền, nhưng các giống chọn ra từ các tổ hợp lai của chúng không duy trì được tính kháng như vậy (Ou, 1985). Phương pháp giống nhiều dòng, nhiều giống kháng dọc luân phiên nhau trên thực tế không có hiệu quả (Ikehashi and Khush, 1979).
Ou (1979) đề xuất lý thuyết tính kháng bền đạo ôn của lúa. Lý thuyết này dựa vào tính đa dạng của thành phần nòi nấm. Một giống lúa tích lũy càng nhiều gen kháng, khả năng kháng bệnh càng cao, nhà chọn giống cần lai nhiều tổ hợp với bố mẹ có tính kháng cao và chỉ chọn những dòng có ít vết bệnh. Teng (1993) đề xuất sử dụng gen Pyramid, hai hay nhiều gen lớn tích lũy vào một giống cải tiến.
* Zeigler (1993) đề xuất giả thuyết “loại trừ dòng” để phát triển giống kháng bền:
1. Quần thể nấm đạo ôn bao gồm những dòng vô tính có tổ tiên chung; 2. Từng dòng vô tính có phổ độc riêng;
3. Một giống được tích lũy bởi một số gen kháng có thể kháng với mọi dòng vô tính của quần thể.
* Zeigler (1993) cũng đề xuất trình tự tạo giống kháng bền bệnh đạo ôn: 1. Xác định thành phần dòng của quần thể nấm và phổ độc tương ứng của chúng;
2. Tìm và tách gen kháng theo mục đích chọn tạo giống;
3. Xác định đặc điểm gen kháng để có hiệu quả cho “loại trừ dòng”; 4. Gom gen kháng vào giống cải tiến sử dụng cho từng vùng sinh thái; 5. Nắm bắt đầy đủ cơ sở kháng bệnh của giống;
Với phương tiện sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể phân tích thành phần dòng của nấm P. grisea, gen kháng ở giống lúa và triển vọng có thể chọn tạo được giống kháng bền theo ý muốn (Zeigler, 1993).
Theo Nguyễn Thị Phong Lan và cs. (2015), độc tính của nguồn nấn P. grisea gây bệnh đạo ôn lúa có biến động giữa các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Một số gen kháng còn hiệu lực cao ở ĐBSCL là Pik-s (IRBLksf-S), Pik-p, Pik-h, Pi9(s)(IRBL9-W), Pish (IRBLsh-S), Pii, Piz-5, Pita (IRBLta-K1) có thể sử dụng trong các chương trình lai tạo giống kháng bệnh cho vùng ĐBSCL. 2.16. VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG NẤM ĐẠO ÔN
Lê Như Kiều và cs. (2007) đã phân lập và thu thập được 60 isolates mẫu nấm gây bệnh đạo ôn trên 26 giống lúa khác nhau ở các tỉnh Hà Nam, Thái Bình, Hưng Yên, Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình và Phú Yên. Bước đầu tuyển chọn được 4 chủng vi khuẩn (RH1, RH6, RH8 và RH13) phân lập từ rễ hành có khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng của nấm P. oryzae gây bệnh đạo ôn.
Tại ĐBSCL các chủng sinh lý cho hiệu quả cao trong phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng bao gồm Bacillus amyloliquefacien strain 26, Streptomyces viriabilis strain 28, Streptomyces fulvissimus strain 30 là nguồn tác nhân tiềm năng nguồn vi sinh vật bản địa quý cần được nhân rộng trong sản xuất (Nguyễn Thị Phong Lan và cs., 2015).
2.17. PHÒNG TRỪ BỆNH ĐẠO ÔN
Theo Nguyễn Văn Viên và cs. (2013), nấm đạo ôn có nhiều hình thức bảo tồn trong tự nhiên: Bằng sợi nấm và bào tử ở hạt giống, rơm rạ, cỏ dại, lúa chét sau gặt, truyền lan bệnh bằng nhiều con đường khác nhau. Vì vậy phòng ngừa và khống chế bệnh hại cần thiết phải áp dụng đồng bộ một hệ thống các biện pháp tổng hợp trong đó bao gồm các biện pháp kỹ thuật trồng trọt, sử dụng giống kháng bệnh cơ cấu giống theo mùa vụ thích hợp kết hợp với các biện pháp hóa học và vệ sinh đồng ruộng nhằm chủ động phòng ngừa bệnh và ngăn chặn sự phát triển bệnh thành dịch, đảm bảo được năng suất ổn định của giống lúa gieo trồng.
Theo Nguyễn Thị Phong Lan và cs. (2015), áp dụng mô hình ứng dụng quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh đạo ôn hại lúa giúp giảm 82.45% tỷ lệ
bệnh, 89,9% chỉ số bệnh đạo ôn lá và 79,55% tỷ lệ bệnh đạo ôn cổ bông, tiết kiệm chi phí và tăng hiệu quả đầu tư 39,12% tại vụ Đông Xuân 2014-2015 ở vùng ĐBSCL.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav
Nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav. được thu thập từ các mẫu bệnh đạo ôn ngoài đồng ruộng trên các giống lúa thuộc khu vực huyện Chương Mỹ - Hà Nội. Các mẫu thu thập được bảo quản tươi đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập bằng phương pháp cấy đơn bào tử. Các mẫu sau khi phân lập được sử dụng để làm nguồn nghiên cứu.
Bảng 3.1. Nguồn mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav. đã được thu thập
STT Từ giống lúa Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu mẫu nấm phân lập
1 Khang dân 18 Xã Phú Nghĩa KD
2 Nếp 203 Xã Lam Điền N203
3 Nếp Lang Liêu Xã Thụy Hương NLL
4 Q5 Xã Trường Yên Q5
Nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav duy trì tại phòng thí nghiệm bộ môn bệnh cây học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã phân lập được trên các mẫu bệnh đạo ôn ở khu vực Chương Mỹ - Hà Nội.
3.1.2. Các giống lúa
- 12 giống lúa Nhật Bản dùng để xác định mã số chủng sinh lý nấm P. oryzae
STT Tên giống lúa chỉ thị Stt Tên giống lúa chỉ thị
1 Shin 2 7 Yashiromochi
2 Aishi- asahi 8 Pino 4
3 Ishikari- shiroke 9 Toride 1
4 Kanto 51 10 K60
5 Tsuyuake 11 BL1
6 Fukunishiki 12 K59
- Các giống lúa: Khang dân, Q5, nếp Lang liêu, nếp 203, Thiên ưu, TH3-5, Nếp thơm 16, Bắc thơm 7, TBR225 dùng để điều tra theo dõi ngoài đồng ruộng, tiến hành thử nghiệm lây bệnh nhân tạo và thử nghiệm thuốc trong nhà lưới.
3.1.3. Các hoá chất và các nguyên vật liệu khác dùng trong thí nghiệm
Cồn 960, agar, khoai tây, cám gạo, giấy quỳ, kiềm, axit, đường glucose, đường saccarose, …
3.1.4. Thuốc trừ nấm
STT Tên thương mại Hoạt chất Công ty sản xuất
1 Amistar Top 325SC
Azoxystrobin 200g/l Difenoconazole 125g/l
Công ty TNHH Syngenta Việt Nam 2 Hibim 31WP Kasugamycin 2% Tricyclazole 29% Công ty sản phẩm công nghệ cao (HP) 3 Vista 72.5WP Thiophanat-Methyl 35% Tricyclazole 37,5% Công ty cổ phần khử trùng Việt Nam
3.1.5. Các loại môi trường nhân tạo để nuôi cấy và phân lập nấm Pyricularia
oryzae Cav
* Môi trường WA (Nước - Aga): dùng để lấy đơn bào tửnấm P. oryzae
* Môi trường PSA (Khoai tây - đường saccarose - aga): dùng để giữ nấm P. oryzae
* Môi trường PDA (Khoai tây – đường glucose – aga): dùng để nuôi cấy nấm * Môi trường cám – agar: Dùng để nhân nguồn bào tử nấm P. oryzae
*Môi trường PSA nghiêng trong ống nghiệm: dùng để giữ nấm 3.1.6. Các dụng cụ thí nghiệm
Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, panh, kéo, thước đo, bút dạ, đũa thuỷ tinh, lam, lamen, chổi lông, kính hiển vi, kính soi nổi, nồi hấp, tủ sấy, buồng cấy, bình phun, cọc thẻ, giấy thấm, vải lọc ….
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Điều tra thành phần và mức độ phổ biến của một số bệnh chính trên lúa xuân 2016 lúa xuân 2016
3.2.2. Điều tra tình hình bệnh đạo ôn trên lúa xuân 2016
3.2.3. Điều tra ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái, kỹ thuật đến bệnh đạo ôn trên lúa xuân 2016
3.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm của một số mẫu phân lập nấm P. oryzae
- Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm P. oryzae trên một số môi trường; - Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến phát triển của nấm P. oryzae;
3.2.5. Nghiên cứu hiệu lực của một số thuốc trừ nấm đối với nấm P. oryzae
ở trong phòng và đối với bệnh đạo ôn trên lúa 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp điều tra bệnh
* Điều tra tình hình của bệnh: Điều tra theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại lúa năm 2014 (QCVN 01-