Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.3.Phương pháp phân lập nấm P oryzae
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.3.Phương pháp phân lập nấm P oryzae
Sử dụng phương pháp cấy đơn bào tử bằng kim thủy tinh bao gồm các bước sau:
- Lấy mẫu bệnh điển hình từ đồng ruộng; - Rửa sạch mẫu bệnh dưới vòi nước;
- Đặt mẫu trong đĩa petri có giấy lọc ẩm 3 ngày ở 26 - 28oC; - Kiểm tra nấm trên mẫu dưới kính lúp soi nổi;
- Dùng đũa thủy tinh trang bào tử lên đĩa petri có WA úp ngược; - Úp đĩa ngược trên kính hiển vi, dùng kim thủy tinh lấy 1 bào tử;
- Úp ngược đĩa có PSA trên kính hiển vi, chuyển bào tử từ đầu kim thủy tinh vào đĩa;
- Đặt đĩa trong tủ định ôn 26 – 28oC 3 ngày, tản nấm hình thành; - Cấy nấm vào ống nghiệm có PSA nghiêng, giữ ở nhiệt độ 15 – 25oC. 3.3.4. Phương pháp nuôi cấy nấm trên môi trường nhân tạo
Áp dụng phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (1999).
* Chuẩn bị môi trường: Cám-agar, PSA, PDA; môi trường PSA có pH 5, 6, 7 và 8.
- Bước 1: Chuẩn bị đĩa Petri
Đĩa Petri rửa sạch, để khô, sấy ở tủ sấy đến khi nhiệt độ bên trong tủ sấy lên tới 159oC thì tắt điện, đợi sau 1 tiếng thì mới mở tủ ra lấy đĩa.
- Bước 2: Nấu môi trường:
+ Môi trường PSA: 200 gam khoai tây đã gọt vỏ, cắt lát mỏng + 1.000 ml nước cất đun sôi 30 phút sau đó dùng lớp vải màn (4 lớp) lọc lấy nước khoai tây, cho vào 20 gam Sacarose + 20 gam agar vào khuấy cho tan, thêm nước cất cho đủ 1.000 ml, đun sôi.
+ Môi trường cám gạo agar: 20 gam cám gạo + 1.000 ml nước cất, đun sôi 20 phút, lọc bằng vải màn (4 lớp), cho 5 gam glucose, 20 gam agar vào khuấy cho tan, thêm nước cất cho đủ 1.000 ml, đun sôi.
+ Môi trường PDA: tương tự như nấu môi trường PSA, chỉ thay Sacarose bằng đường Glucose.
Pha môi trường có pH 5, 6, 7 và 8 ta dùng dung dịch NaOH hoặc HCl để nhỏ từ từ vào bình tam giác chứa môi trường PSA, lắc đều. Dùng giấy quỳ để thử độ pH và điều chỉnh độ pH thích hợp dựa vào bảng màu (dùng cho thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của nấm trên các môi trường pH khác nhau).
- Bước 3: Hấp khử trùng:
Cho môi trường đã chuẩn bị vào bình tam giác, bịt nút bông vô trùng, bọc nắp bằng giấy bạc, cho vào nồi hấp. Hấp ở 121oC trong 20 phút.
Pha thuốc vào môi trường (dùng cho thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thuốc Amistar top 325SC đến khả năng phát triển của nấm P. oryzae trên môi trường PSA).
+ Dùng bơm tiêm hút 1 ml thuốc hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch A.
+ Lấy 1 ml dung dịch A hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch B. + Lấy 0,5 ml dung dịch B hòa vào 99,5 ml môi trường được nồng độ 0,005%. + Lấy 1 ml dung dịch B hòa và 99 ml môi trường được nồng độ 0,01%. Lắc cho thuốc hòa đều vào môi trường.
- Bước 4: Đổ môi trường:
Chờ cho bình nguội về 40oC, lắc đều rồi đổ ra đĩa petri.
* Chuẩn bị nguồn nấm: Cấy nấm từ ống nghiệm (ống nguồn) vào đĩa petri chứa môi trường PSA (cấy 1 điểm ở chính giữa đĩa) sau 4 - 6 ngày dùng đĩa đó để làm nguồn cấy nấm.
* Cấy nấm lên các môi trường khác nhau: Từ nguồn nấm thuần đã chuẩn bị làm nguồn cấy ở trên, ta dung đột tròn có đường kính 5 mm đột nấm ở đĩa theo đường tròn của đĩa nguồn nấm (để các khoanh nấm có cùng ngày tuổi) sau đó dùng que cấy lấy từng khoanh cấy trên các môi trường đã chuẩn bị (mỗi đĩa cấy 1 khoanh ở chính giữa đĩa petri, mỗi môi trường cấy 3 đĩa).
* Các chỉ tiêu theo dõi
- Sau khi cấy để đĩa nấm và tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC (thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của nấm ở các mức nhiệt độ thì ta đặt nhiệt độ ở các mức 15, 20, 25 và 30oC), đo đường kính của tản nấm sau khi cấy 2, 4, 6, 8 ngày (đối với thí nghiệm khảo sát hiệu lực của thuốc đối đo cả đường kính tản nấm sau 10 ngày
cấy), đo gián tiếp ở phía ngoài đĩa petri, không mở hộp, đo 2 lần theo chiều vuông góc đia qua tâm của đĩa theo hình dấu cộng (+).
* Xử lý số liệu theo chương trình IRRISTAT của Viện nghiên cứu lúa Quốc tế.
3.3.5. Phương pháp đo kích thước bào tử nấm và đếm tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm bào tử nấm
Áp dụng phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (1999).
- Cấy nấm lên đĩa petri chứa môi trường PSA, sau khi cấy 14 ngày, rửa sạch sợi nấm trên bề mặt đĩa petri bằng chổi lông vô trùng và nước cất. Để khô sau đó đặt đĩa vào trong tủ để 12 giờ sáng, 12 giờ tối trong 3 ngày để nấm sinh bào tử. Sau đó dùng 20 ml nước cất có Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho vào 1 hộp petri, lấy 1 giọt dung dịch bào tử nhỏ lên lam đậy lamen lại đưa lên kính hiển vi quan sát.
- Đo kích thước bào tử nấm: dùng thước đo kính hiển vi quang học, thước có 10 vạch lớn, mỗi vạch lớn có 10 vạch nhỏ như vậy tổng có 100 vạch nhỏ. Đo ở vật kính 40, mỗi vạch nhỏ của thước bằng 2,5 µm. Đếm số vạch rồi nhân lên với 2,5 là ra kích thước cần đo. Mỗi mẫu phân lập đo 30 bào tử.
- Đếm tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm: Mầm dài bằng 2/3 độ dài bào tử thì được tính là nảy mầm (theo Plant Phytopathology), đếm 5 quang trường, mỗi quang trường 15 – 20 bảo tử.
- Xử lý số liệu theo chương trình Excel. 3.3.6. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
* Chuẩn bị cây mạ
- Ngâm hạt lúa giống cho này mầm, đem gieo vào các khay nhựa có bùn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống gieo 2 hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau đó chờ vài ngày cho cây bám rễ và mọc thành cây tăm ta đem ngâm vào bể, hoặc chú ý tưới nước, chăm sóc cho cây phát triển bình thường. Sau khi gieo 20-22 ngày (cây có khoảng 4 lá thật) thì phun dung dịch bào tử để lây bệnh.
* Chuẩn bị nguồn bào tử để lây nhiễm
- Lấy nấm từ ống nghiệm lưu giữ nguồn đã phân lập cấy lên đĩa petri chứa môi trường PSA, mỗi mẫu phân lập cấy 2 đĩa, mỗi đĩa cấy 3 điểm sau đó đặt đĩa đã cấy vào tử định ôn 28oC sau 2 tuần, lúc này sợi nấm sẽ mọc kín môi trường.
- Lấy đĩa nấm ra khỏi tủ, dùng bình tia phun nước cất vào, dùng chổi lông quét đi, quét lại nhiều lần trên bề mặt đĩa, dùng bình tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước quét khô mặt thạch (mỗi mẫu phân lập dùng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sôi).
- Đặt đĩa nấm trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối sau 3 ngày để bào tử hình thành. Dùng 20ml nước vô trùng có pha Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho một đĩa petri. Lấy 1 giọt dung dịch bào tử đã rửa ở trên nhỏ lên lam kính soi dưới kính hiển vi. Đếm số bào tử trên quang trường 10X. Điều chỉnh dung dịch bào tử sao cho có khoảng 30-50 bào tử trên quang trường tương đương với 105 bào tử/ml, đếm 5 quang trường 10X.
* Lây nhiễm
Sử dụng bình phun cầm tay loại dung tích 0,5 lít để phung dung dịch lên lúa, phun ướt đều các lá lúa. Sau đó đặt khay lúa trong tủ lây nhiễm, phun và giữ ẩm liên tục trong 20 giờ (ẩm trên 90%), sau đó đem lúa đã lây nhiễm ra khỏi tủ ẩm đặt dưới ánh sáng tán xạ, tưới nước đầy đủ để lúa vẫn tiếp tục phát triển.
* Đánh giá
Quan sát thời gian (ngày) kể từ khi lây nhiễm tới khi xuất hiện vết bệnh đầu tiên.
Sau 7 ngày lây nhiễm tiến hành đánh giá phản ứng của các giống lúa theo thang phân cấp của Kato, 1993.
Cấp 0: không có vết bệnh, kháng cao (HR)
Cấp 1: vết bệnh là một chấm nhỏ bằng đầu kim, kháng (R) Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nâu nhạt đến nâu tối, kháng (MR) Cấp 3: Vết bệnh to hơn màu xám ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
Cấp 4: Vết bệnh điển hình (hình thoi có màu xám ở giữa), nhiễm nặng (HS)
Cấp 0, 1, 2: kháng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh
3.3.7. Phương pháp xác định mã số chủng sinh lý nấm P. oryzae
Sau khi lây bệnh nhân tạo trên 12 giống lúa Nhật Bản, các giống có mức
nhiễm S được dùng để tính mã số chủng sinh lý nấm P. oryzae bằng cách hàng
trăm cộng với nhau, hàng chục cộng với nhau, hàng đơn vị cộng với nhau và hàng thập phân cộng với nhau.
3.3.8. Phương pháp xác định hiệu lực của thuốc
3.3.8.1. Phương pháp xác định hiệu lực của thuốc Amistar top 325 SC trong phòng thí nghiệm
CT1: Thuốc Amistar top 325SC nồng độ 0.01%; CT2: Thuốc Amistar top 325SC nồng độ 0.005%; CT3: Đối chứng (dùng nước cất vô trùng).
Tiến hành nhắc lại 3 lần với mỗi công thức. Quan sát hiệu lực của thuốc ở các nồng độ khác nhau và đưa ra kết luận.
Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính tản nấm trong vòng 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau cấy của các công thức.
Hiệu lực ức chế thuốc trong phòng thí nghiệm được tính theo công thức Abbott: C - T
HLĐK (%) = --- x 100 C
Trong đó: C: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng ;
T: đường kính tản nấm ở công thức có xử lý thuốc.
3.3.8.2. Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc Amistar top 325 SC trong nhà lưới
- Gieo giống Q5 trên khay nhựa (cách ngâm ủ mạ tương tự phương pháp lây bệnh nhân tạo), mỗi khay gieo 3 hàng đôi, mỗi hàng 10 hạt.
- Khi cây có khoảng 4 lá thật tiến hành 2 thí nghiệm: thí nghiệm phun thuốc trước 1 ngày sau đó lây bệnh và thí nghiệm lây bệnh trước 1 ngày sau đó phun thuốc.
- Pha thuốc Amistar top 325SC với 3 nồng độ: 0,01%; 0,015% và 0,02%. - Điều tra tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh sau phun 7 ngày.
Đánh giá hiệu lực của thuốc bằng công thức Abbott C - T
HLĐK (%) = --- x 100 C
Trong đó: C: chỉ số bệnh ở công thức đối chứng sau 7 ngày lây bệnh ; T: chỉ số bệnh ở công thức có xử lý thuốc sau 7 ngày lây bệnh.
3.3.8.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc ngoài đồng ruộng đối với bệnh đạo ôn lá trên giống TBR225
Áp dụng quy phạm khảo nghiệm trên đổng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh đạo ôn hại lúa của các thuốc trừ nấm. Tiêu chuẩn ngành 10TCN 157-92.
- Bố trí thí nghiệm 4 công thức
+ Công thức 1: Amistartop 325SC 500 ml/ha; + Công thức 2: Hibim 31WP 500 g/ha;
+ Công thức 3: Vista 72.5WP 500 g/ha; + Công thức 4: đối chứng phun nước lã.
- Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại có diện tích ô 50 m2. - Thời gian điều tra: trước phun 1 ngày và sau phun 5, 10, 15 ngày.
- Điểm điều tra: mỗi lần nhắc lại điều tra 5 điểm cố định, mỗi điểm 10 cây liên tiếp, mỗi cây điều tra toàn bộ số lá của 1 dảnh ngẫu nhiên.
- Chỉ tiêu điều tra, cách tính tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh giống điều tra đồng ruộng.
- Hiệu lực của thuốc được tính theo công thức Henderson Tilton:
Hiệu lực (%) = (1 )x100
CaxTb TaxCb
Trong đó: Ta: Chỉ số bệnh ở ô xử lý thuốc sau khi phun;
Tb: Chỉ số bệnh ở ô xử lý thuốc trước khi phun;
Ca: Chỉ số bệnh ở ô đối chứng sau khi phun;
Cb: Chỉ số bệnh ở ô đối chứng trước khi phun.
3.3.9. Phương pháp xử lý thống kê
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. THÀNH PHẦN BỆNH HẠI LÚA TẠI HUYỆN CHƯƠNG MỸ - HÀ NỘI Trên lúa có thành phần bệnh rất đa dạng, tùy vào đặc điểm từng địa Trên lúa có thành phần bệnh rất đa dạng, tùy vào đặc điểm từng địa phương, cơ cấu giống và biện pháp kỹ thuật mà thành phần và mức độ hại của bệnh ở các vùng khác nhau. Qua điều tra chúng tôi nhận thấy tại vụ lúa xuân năm 2016, huyện Chương mỹ có một số đối tượng bệnh hại chính như sau:
Bảng 4.1. Thành phần bệnh hại lúa vụ xuân tại huyện Chương Mỹ - Hà Nội STT STT
Tên bệnh
Giai đoạn cây bị bệnh Bộ phận bị hại Mức độ gây hại Tên Vệt
Nam Tên khoa học
1 Đạo ôn Pyricularia oryzae Cav. Đẻ nhánh-chín Thân, lá,
bông ++
2 Đốm nâu Curvulariaoryzae Mạ-chín Lá +
3 Khô vằn Rhizoctonia solani Làm đòng-chín Thân, lá,
bông ++ 4 Bạc lá Xanthomonas campestris pv. oryzae Đẻ nhánh-chín Lá + 5 Đốm sọc vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. oryzicola Đẻ nhánh-chín Lá +++ 6 Lem lép hạt Chưa xác định Chín Hạt + Ghi chú: + bệnh nhẹ TLB<5%; ++bệnh trung bình TLB 5-10%; +++bệnh nặng TLB >10%
Qua bảng 4.1 cho thấy: thành phần bệnh hại lúa xuân tại huyện Chương Mỹ rất đa dạng; giai đoạn bị bệnh, bộ phận bị hại và mức độ gây hại giữa các bệnh là khác nhau. Bệnh xuất hiện từ khi lúa ở giai đoạn mạ cho đến khi thu hoạch, bệnh gây hại trên khắp các bộ phận của cây từ lá, thân, bông,... chủ yếu là bệnh gây hại nhiều trên lá từ giai đoạn đẻ nhánh đến thu hoạch.
Bệnh gây hại nặng điển hình là bệnh đốm sọc vi khuẩn, nếu bệnh xuất hiện khi cây lúa ở giai đoạn đẻ nhánh khi mà bộ lá lúa có khả năng đền bù cao thì ít gây ảnh hưởng đến năng suất. Khi lúa bước vào giai đoạn trỗ đến chín, lúc này nếu bệnh gây hại sẽ làm mất diện tích quang hợp của cây, gây ảnh hưởng lớn đến năng suất thậm trí cây không cho năng suất.
Tiếp đến là bệnh khô vằn và bệnh đạo ôn. Bệnh khô vằn xuất hiện xuất hiện muộn hơn bệnh đạo ôn nhưng bệnh lại gây hại trên diện rộng và tỷ lệ bệnh cao hơn. Tuy nhiên thiệt hại năng suất do bệnh khô vằn gây ra ít nghiêm trọng hơn so với bệnh đạo ôn. Bệnh đạo ôn lá nếu không kiểm soát tốt sẽ là nguồn bệnh nguy hiểm tấn công vào cổ bông lúa, cắt đứt con đường vận chuyển dinh dưỡng từ thân lên nuôi hạt làm mất hoàn toàn hoặc gây giảm năng suất nghiêm trọng.
Các bệnh đốm nâu, bạc lá và lem lép hạt gây hại nhẹ.
4.2. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA VỤ XUÂN 2016 TẠI HUYỆN CHƯƠNG MỸ - HÀ NỘI XUÂN 2016 TẠI HUYỆN CHƯƠNG MỸ - HÀ NỘI
4.2.1. Diễn biến bệnh đạo ôn trên một số giống trồng lúa trồng đại trà vụ xuân năm 2016 tại huyện Chương Mỹ - Hà Nội xuân năm 2016 tại huyện Chương Mỹ - Hà Nội
Trong vụ xuân 2016, trên địa bàn huyện Chương Mỹ các giống lúa được gieo trồng phổ biến là TBR225, Nếp Lang liêu, Bắc thơm, Q5, Khang dân, Thiên ưu, TH3-5,... Chúng tôi đã tiến hành điều tra, theo dõi sự phát sinh, phát triển của bệnh đạo ôn ngay từ giai đoạn mạ đến chín sáp. Kết quả được trình bày tại bảng 4.2.
Qua bảng 4.2 điều tra 8 giống lúa cho thấy:
Vụ Xuân năm 2016, bệnh đạo ôn bắt đầu phát sinh gây hại ở giai đoạn lúa đẻ nhánh trên các giống Khang dân, Bắc thơm, Nếp thơm 16, nếp Lang liêu và TBR225; Sang giai đoạn lúa đứng cái bệnh tiếp tục phát triển và có thêm giống Q5 bị bệnh. Giai đoạn lúa làm đòng là giai đoạn bệnh hại nặng nhất trên các giống lúa.
Bệnh hại nặng nhất trên giống nếp Lang liêu, ở giai đoạn làm đòng tỷ lệ bệnh là 15,8%, chỉ số bệnh là 4,2%; giống bị hại nặng tiếp theo là Bắc thơm có tỷ