Phương pháp PCR được tiến hành nhằm khẳng định lại một lần nữa sự hiện diện của gen chuyển sau thử nghiệm leaf – painting. Thơng thường chỉ cĩ những cá thể kháng tồn bộ (R-R-R) mới cần làm thí nghiệm này, tuy nhiên trong phạm vi luận văn chúng tơi đã tiến hành thực hiện trên cả 3 trường hợp R-R-R, R-R-S, S-S-S nhằm đối chiếu, so sánh.
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi chuyên biệt cho gen bar với đối chứng dương cho phản ứng là plasmid pZY 101 – Tnt1 được tách chiết từ chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm, đối chứng âm cho phản ứng là nước cất và đối chứng âm cho thể chuyển gen là DNA của cây đậu nành Maverick chưa chuyển gen. Sau phản ứng PCR, sản phẩm được chạy điện di trên gel Agarose 1% và quan sát qua máy chụp gel, kết quả thu được như sau (hình 3.18):
- Ở mẫu nước cất làm đối chứng âm cho phản ứng, khơng cĩ vạch nào xuất hiện trên bảng diện di.
- Ở mẫu đối chứng âm cho cây đậu nành Maverick chưa chuyển gen, khơng phát hiện vạch nào trên bảng điện di chứng tỏ cây đậu nành trước khi chuyển gen khơng mang gen bar.
- Ở mẫu chứng dương là plasmid pZY 101 – Tnt1, một vạch sáng được ghi nhận tại vị trí gần với vạch 200 bp của thang 1 kb. Như vậy, cĩ sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại dài 231 bp trên mẫu chứng dương.
- Ở các giếng DNA chuyển gen giả định cĩ kết quả là S-S-S trong thử nghiệm leaf – painting, khơng cĩ vạch nào được ghi nhận. Do vậy, cĩ thể khẳng định các cây này là các thể escape.
- Ở các cây R-R-R, vạch sản phẩm được thể hiện sáng rõ, đậm trên bảng điện di. Như vậy, các cây này là các cá thể đã được sáp nhập gen bar vào genome.
- Ở các cây R-R-S và R-S-S, sản phẩm PCR cũng được ghi nhận. Tuy nhiên các vạch này mờ hơn, do đĩ cĩ thể khẳng định đây là các cây dạng thể khảm.
Kết quả PCR trên chứng minh rằng cĩ sự hiện diện của gen chuyển trong DNA tế bào của các cây kháng với Liberty sau quá trình biến nạp gen.
4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
Với kết quả thu được như trên, luận văn đã thành cơng trong việc chuyển plasmid pZY 101 – Tnt1 nhờ Agrobacterium tumefaciens AGL1 vào cây đậu nành Glycine max giống Maverick. Một số thơng số của quá trình chuyển nạp được tối ưu như sau:
- Khẳng định cassette mang gen chuyển cĩ gen Tnt1.
- Chuyển thành cơng plasmid mang gen Tnt1 và bar với các thơng số: + Lá mầm 5 ngày tuổi
+ Thời gian đồng nuơi cấy 5 ngày
+ Nồng độ vi khuẩn OD650= 0,6.
- Tác nhân chọn lọc thể chuyển gen là glufosinate nồng độ 10 mg/l. - Meropenem 10 mg/l kết hợp với timentin 50 mg/l cĩ thể thay thế
cefotaxime và vancomycine trong quá trình loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuơi cấy.
- 52 dịng chuyển gen cĩ sức sống tốt, tỉ lệ sống ngồi vườn ươm
96,15%.
- Kết quả leaf-painting: 9 cây R-R-R, 6 cây R-R-S, 3 cây R-S-S và 5 cây S-S-S.
- Tín hiệu PCR dương tính được ghi nhận ở tất cả cây kháng nhưng khơng cĩ ở các cây nhạy.
Hình 4. 1: Quy trình chuyển gen trên đậu nành bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens.
1: Khử trùng hạt, 16 giờ; 2: Gieo hạt, 5 ngày; 3: Tạo vết thương và đồng nuơi cấy với A. tumefaciens, 5 ngày; 4: Tạo chồi trên mơi trường SI khơng cĩ glufosinate, 2 tuần; 5: Chọn lọc chồi trên mơi trường SI bổ sung 10 mg/l glufosinate, 2 tuần; 6: Kéo dài chồi trên mơi trường SE bổ sung 4 mg/l glufosinate, cấy chuyền 2 tuần / lần; 7: Ra rễ, 10 – 14 ngày; 8: Ra vườn ươm; 9: Kiểm tra cây chuyển gen bằng phương pháp leaf – painting, PCR.
Trên cơ sở các kết quả thu được, các hướng nghiên cứu tiếp theo cần được triển khai nhằm hoàn thiện quy trình và đưa ra ứng dụng:
- Tiếp tục thu nhận các chồi chuyển gen giả định, trồng và thử nghiệm leaf – painting để tính hiệu suất chuyển gen.
- Thực hiện các phương pháp phân tích kiểu hình trên cây đậu nành chuyển gen nhằm đánh giá tác động của retrotransposon Tnt1.
- Khảo sát sự di truyền và tính đa hình của gen Tnt1 bằng phương pháp lai Southern Blot qua các thế hệ.
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Bùi Lan Anh, Trần Lê Lưu Ly, Nguyễn Hữu Hổ, Bùi Văn Lệ (2010),
Ứng dụng kháng sinh meropenem trong chuyển gen bằng phương pháp
Agrobacterium tumefaciens trên lan Hồ Điệp (Phalaenopsis amabilis L.), Hội nghị CNSH tồn quốc khu vực phía nam 2009, trang 737 – 740. [2]. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004), Di truyền phân tử, Nxb Nơng
Nghiệp Tp Hồ Chí Minh, trang 473-480, 488-490, 492-495, 488-497. [3]. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, Nxb Giáo Dục, trang
122-124, 129-130, 190-199.
[4]. Phạm Hồng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam – An Illustrated Flora of Vietnam Quyển I, NXB Trẻ, trang 949.
[5]. Ngơ Đằng Phong, Huỳnh Thị Thùy Trang, Nguyễn Duy Năng (2004),
Hướng dẫn sử dụng phần mềm MSTATC trong phương pháp thí nghiệm nơng nghiệp, Bộ mơn Thủy nơng, khoa Nơng học, trường Đại học Nơng Lâm Tp HCM.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[6]. Baldwin C., Williamson K., Keam S. (2008), Meropenem - A Review of its Use in the Treatment of Serious Bacterial Infections, Drugs 2008; 68 (6): 803 - 838.
[7]. Casacuberta J., Santiago N. (2003), Plant LTR-retrotransposons and MITEs: control of transposition and impact on the evolution of plant genes and genomes, Gene 311, p 1-11.
[8]. Dennehey B., Petersen W., Santino C., Armstrong M. (1994),
Comparison of selective agents for use with the selectable marker gene bar in maize transformation, Plant Cell Tissue and Organ Culture 36: 1 – 7.
[9]. Di R., Purcell V., Collins B., Ghabrial A. (1996), Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gene, Plant Cell Rep. 15: 746 –750.
[10]. Dong Z., Jia R. (1991), High efficiency plant regeneration from cotyledons of watermelon (Citrullus vulgaros Schrad.), Plant Cell Report 9: 559 – 562.
[11]. FAO (Food and Agricultural Organization of the United Nations) (2002), FAOSTAT statistics database. Rome: UN Food and Agriculture Organization.
[12]. Flaskerud G. (2003), Brazil’s soybean production and impact, North Dakota State University Fargo North Dakota
[13]. Fullner J., Nester W. (1996), Temperature affects the T-DNA transfer machiney of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology,
178(6), pp. 14 - 98.
[14]. Grandbastien A. (1998), Activation of plant retrotransposon under stress conditions, TRENDS in plant science, Vol. 3, No. 5, pp 181 – 187.
[15]. Gogvadze E., Buzdin A. (2009), Retroelements and their impact on genome evolution and functioning, Cellular and Molecular Life Sciences, Vol 66, 3727 – 3742.
[16]. Hammerschlag, Zimmerman (1995), An evaluation of antibiotics for elimination of Agrobacterium tumefaciens from apple leaf explants in vitro and for the effect of regeneration, Horticultural Science, 30, pp. 876.
[17]. Hansen G., Chilton D. (1996), “Agrolistic” transformation of plant cell: Intergration of T-strands generated in planta, Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 93, pp. 14978 - 14980.
[18]. Hou Y., Rajagopal J., Irwin P., Voytas D. (2010), Retrotransposon vectors for gene delivery in plants, Mobile DNA pp 1 – 19. http://www.mobilednajournal.com/content/1/1/19
[19]. Kumar A. et al (1999), Plant Retrotransposon, Annu. Rev. Genet. 1999. 33:479 –532.
[20]. Kumar A., Hirochika H. (2001), Applications of retrotransposon as genetic tools in plant biology, TRENDS in Plant Science Vol. 6, No.3, pp 127 – 133.
[21]. Kushikawa S., Miyoshi K., Mii M. (2002), Pre-Culture Treatment Enhances Transient GUS Gene Expression in Leaf Segment of Saintpaulia ionantha Wendl. after inoculation with Agrobacterium tumefaciens, Plant Biotechnology, 19 (2), pp. 149 - 152.
[22]. Li Z. et al (2007), A Cre/loxP-mediated self-activating gene excision system to produce marker gene free transgenic soybean plants, Plant Mol Biol (2007) 65:329–341.
[23]. Liu J., Su Q., An L., Yang A. (2009), Transfer of a minimal linear marker-free and vector-free smGFP cassette into soybean via ovary- drip transformation, Biotechnol Lett (2009) 31:295–303.
[24]. Lodish H., Berk A., Matsudarw P., Kaiser C., Krieger M., Scott M., Zipursky L., Darnell J. (2004), Molecular Cell Biology Fifth edition, Massachusetts Institute of Technology, pp 414-424.
[25]. Lu G., Han F., Tallmam J., Klein T., Zhang J. (2008), Compedium of Transgenic Crop Plants: Transgernic Oilseed Crops – Soybean,
Blackwell Publishing Ltd., p. 1 – 65.
[26]. Lucas H., Feuerbach F., Kunert K., Grandbastien A., Caboche M. (1995), RNA-mediated transposition of the tobacco retrotransposon Tntl in Arabidopsis thaliana, The EMBO Journal vol.14 no.10 pp.2364 - 2373.
[27]. Mathieu M. et al (2009), Establishment of a soybean (Glycine max Merr. L) transposon-based mutagenesis repository, Planta (2009) 229:279–289.
[28]. Mayolo A., Maximova N., Pishak S., Guiltinan J. (2003), Moxalactam as a counter-selection antibiotic for Agrobacterium-mediated transformation and its positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis, Plant Science, 164, pp. 607 - 615.
[29]. Mazier M. (2007), Successful Gene Tagging in Lettuce Using the Tnt1Retrotransposon from Tobacco, Plant physiology, 144 (1): 18.
[30]. Ogawa Y., Mii M. (2004), Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens, Archives of Microbiology, 181, pp.331–336.
[31]. Ogawa Y., Mii M. (2005), Evaluation of 12 β-lactam antibiotics for Agrobacterium-mediated transformation through in planta antibacterial activities and phytotoxicities, Plant Cell Reports, 23, pp. 736–743.
[32]. Ogawa Y., Mii M. (2007), Meropenem and moxalactam: Novel b- lactam antibiotics for efficient Agrobacterium-mediated transformation, Plant Science, 172, pp. 564–572.
[33]. Opabode T. (2006), Agrobacterium-mediated transformation of plant: emerging factors that influence efficiency,Biotechnology and Molecular Biology Review, 1(1), pp. 12 - 20.
[34]. Paz M., Shou H., Guo Z., Zhang Z., Banerjee A. và Wang K. (2004),
Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explants, Euphytica 136: 167–179.
[35]. Pena L. (2005), Transgenic Plant: Methods and Protocols. In: Methods in Molecular Biology, Vol 286, Pena L. (Ed), Human Press, pp. 61 - 77.
[36]. Querci M., Mazzara M. (2004), The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms. Session 7: Characteristics
of Roundup Ready Soybean, Mon810 Maize, and Bt-176 Maize, EU Legislation, World Health Organization Regional Office for Europe. [37]. Rao S. (2009), Non-antibiotic selection systems for soybean somatic
embryos: the lysine analog aminoethyl-cysteine as a selection agent,
BMC Biotechnology 2009, 9:94.
[38]. Sacks M., Lichtenstein A., Van Horn L., Harris W., Etherton P., Winston M. (2006), Soy protein, isoflavones, and cardiovascular health: an American Heart Association Science Advisory for professionals from the Nutrition Committee, Circulation 113 (7): 44 – 1034.
[39]. Sambrook J., Russell D. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , NY, pp. 31–34.
[40]. Schnittker J. (1997), The history, trade, and environmental consequences of soybean production in the United States, Report to the World Wildlife Fund, p 110.
[41]. Sharma K., Mathur B., Thorpe, T. (2004), Genetic Transformation Technology: Status and Problems, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 41, pp. 102 - 112.
[42]. Sirtori R. (2001), Risks and benefits of soy phytoestrogens in cardiovascular diseases, cancer, climacteric symptoms and osteoporosis, Drug safety: an international journal of medical toxicology and drug experience 24 (9): 82 – 655.
[43]. Sjahril R., Mii M. (2006), High-efficiency Agrobacterium -mediated transformation of Phalaenopsis using meropenem, a novel antibiotic to eliminate Agrobacterium, Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 81 (3), pp. 458 - 464.
[44]. Stanton G. (2003), Agrobacterium - Mediated Plant Transformation: The Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool, Microbiololy and Molecular Biology Reviews, 67(1), pp. 16 - 37.
[45]. Tadege M. et al (2008), Large-scale insertional mutagenesis using the Tnt1 retrotransposon in the model legume Medicago truncatula, The Plant Journal (2008) 54, 335–347.
[46]. Todorovska E. (2007), Retrotransposons and their role in plant – genome evolution, Biotechnol. And Biotechnol. EQ. 21/2007/3, pp 294 – 305.
[47]. Tougou M. et al (2007), Soybean dwarf virus-resistant transgenic soybeans with the sense coat protein gene, Plant Cell Rep 26:1967– 1975.
[48]. Tougou M. et al (2009), The application of the mutated acetolactate synthase gene from rice as the selectable marker gene in the production of transgenic soybeans, Plant Cell Rep 28:769–776.
[49]. Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai, La Cao Thang (2008), Transformation efficiencies of the soybean variety pc 19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method, Omonrice 16: 1 - 8 (2008).
[50]. Trick H. et al (1997), Recent advances in soybean transformation, Plant tissue culture and Biotechnology, Vol.3. No1, pp 9 – 26.
[51]. Tzfira T., Citovsky V. (2002), Partners-in-infection host proteins involved in the transformation of plant cells by Agrobacterium, Trend in Cell Biology, 12(3), pp. 121 - 129.
[52]. Tzfira T., Citovsky V. (2006), Agrobacterium-mediate genetic transformation of plants: biology and biotechnology, Current Opinion in Biotechnology, 17, pp. 147 - 154.
[53]. Wang G., Xu Y. (2008), Hypocotyl-based Agrobacterium-mediated transformation of soybean (Glycine max) and application for RNA interference, Plant Cell Rep (2008) 27:1177–1184.
[54]. Wang K. (2006) Agrobacterium Protocols, Vol 1-2. in Methods in Molecular Biology, Humana Press. p343 – 344.
[55]. Wang Z., Libault M., Joshi T., Valliyodan B., Nguyen H., Xu D., Stacey G., Cheng J. (2010), SoyDB: a knowledge database of soybean transcription factors, BMC Plant Biol. 10:14.
[56]. Ying S., Niimi Y., Hu L. (2006), Meropenem as an Alternative Antibiotic Agent for Suppression of Agrobacterium in Genetic Transformation of Orchid, Agricultural Sciences in China, 5 (11), pp. 839-846.
[57]. Zhang Z. et al (1999), The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 56: 37 – 46.
[58]. Zia M. et al (2010), Expression of rol genes in transgenic soybean (Glycine max L.) leads to changes in plant phenotype, leaf morphology, and flowering time, Plant Cell Tiss. Organ Cult. 103:227–236.
INTERNET [59]. http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx [60]. http://fotobank.ru/image/SF16-9003.html [61]. http://mulch.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Mutagenesis/ [62]. http://www.cals.ncsu.edu/Agrobacterium/cell.JPG [63]. http://www.ers.usda.gov/News/soybeancoverage.htm [64]. http://www.escience.ws/b572/L20/L20.html [65]. http://www.gmo-compass.org/eng/database/plants/67.soybean.html [66]. http://www.khuyennongvn.gov.vn/e-khcn/trong-111au-nanh-thay-lua- xuan-he-o-111ong-bang-song-cuu-long/view [67]. http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/cgi-bin/list_nut_edit.pl [68]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=62 318478. [69]. http://www.nowpublic.com/environment/soy-bean-field
[70]. http://www.nsrl.uiuc.edu/aboutsoy/photogallery.html [71]. http://www.nsrl.uiuc.edu/aboutsoy/photogallery.html [72]. http://www.soystats.com/2010/Default-frames.htm [73]. http://www.topcropmanager.com/content/view/1450/132/ [74]. http://www.wikipedia.org/soybean.htm [75]. http://www1.astrazeneca-us.com/pi/MerremIV.pdf
PHỤ LỤC
1. Mơi trường khống B5 (Gamborg, 1968)
B5 đa lượng, 10X Hàm lượng (g/l)
KNO3 25 CaCl2.H2O 1,5 MgSO4.7H2O 2,5 (NH4)2.SO4 1,34 NaH2PO4.H2O 1,5 B5 vi lượng, 100X H3BO3 0,3 MnSO4.H2O 1 ZnSO4.7H2O 0,2 KI 0,075 Na2MoO4.2H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,0025 CoCl2.6H2O 0,0025 Fe-EDTA, 100X FeSO4.7H2O 2,8 NaEDTA 3,75
2. Mơi trường khống cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)
MS đa lượng, 10X Hàm lượng (g/l)
NH4NO3 16,5 KNO3 19 CaCl2.H2O 4,4 MgSO4.7H2O 3,7 KH2PO4 1,7 MS vi lượng, 100X
H3BO3 0,62 MnSO4.H2O 1,69 ZnSO4.7H2O 0,86 KI 0,083 Na2MoO4.2H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,0025 CoCl2.6H2O 0,0025 B5 vitamins, 100 X Myo-inositol 10
Nicotinic acid (Niacinamide) 0,1
Pyridoxine-HCl 0,1 Thiamine-HCl 1 Fe-EDTA, 100X FESO4.7H2O 2,8 NaEDTA 3,75 3. Mơi trường nảy mầm hạt đậu nành (GM) Hàm lượng ml/l B5 đa lượng, 10 X 100 B5 vi lượng, 100 X 10 Fe-EDTA, 100X 10 Sucrose 20 g pH 5.8, thêm nước cất đủ 990 Phytagel 3 g B5 vitamin, 100X 10 Hấp khử trùng 20 phút, 121 oC, 1 atm
4. Mơi trường cảm ứng tạo chồi từ nốt lá mầm đậu nành (SI)
B5 đa lượng, 10 X 100 B5 vi lượng, 100 X 10 Ion-NaEDTA, 100X 10 Sucrose 30 g MES 0,6 g pH 5.8, thêm nước cất đủ 980 ml Phytagel 3 g Hấp khử trùng 20 ph, 121 oC, 1 atm Bổ sung hỗn hợp các thành phần sau: - B5 vitamin, 100X 10 - BAP 1,6mg/ml 1 - Timentin 0,05 g - Cefotaxime 0,1 g - Vancomycin 0.05 - Thêm nước đủ 20 ml Lọc vơ trùng
5. Mơi trường đồng nuơi cấy lá mầm đậu nành và vi khuẩn A. tumefaciens
(CC) Hàm lượng ml/l B5 đa lượng, 10 X 10 B5 vi lượng, 100 X 1 Ion-NaEDTA, 100X 1 Sucrose 30 MES 3,9 g pH 5.4, thêm nước cất đủ 920 Agar 7 g Hấp khử trùng 20 ph, 121 oC, 1 atm
Bổ sung hỗn hợp các thành phần sau: B5 vitamin, 100X 10 - Acetosyringone 0,04 g - GA3, 1mg/ml 0.25 - BAP, 1,6mg/ml 1 - L-cysteine 0.4 g - DTT 0,154 - Na-thiosulfate 0,158 - Thêm nước đủ 80 ml Lọc vơ trùng
6. Mơi trường kéo dài chồi đậu nành (SE)
Hàm lượng ml/l MS đa lượng, 10 X 100 MS vi lượng, 100 X 10 Ion-NaEDTA, 100X 10 Sucrose 30 MES 0,6 g
pH 5.8, thêm nước cất cho đủ 975
Phytagel 3 g Hấp khử trùng 20 ph, 121 oC, 1 atm Bổ sung hỗn hợp các thành phần sau: - B5 vitamin, 100X 10 - Zeatin-R, 1mg/ml 1 - GA3, 1mg/ml 0,5 - IAA, 1mg/ml 0,1 - Timentin 0.05 g - Cefotaxime 0.1 g
- Vancomycin 0.05
- Thêm nước đủ 25 ml
Lọc vơ trùng
7. Mơi trường ra rễcây đậu nành in vitro (RM)
Hàm lượng ml/l MS đa lượng, 10 X 100 MS vi lượng, 100 X 10 Fe-EDTA, 100X 10 Sucrose 20 MES 0,6
pH 5.8, thêm nước cất cho đủ 980
Phytagel 3 g Hấp khử trùng 20 ph, 121 oC, 1 atm Bổ sung hỗn hợp các thành phần sau: B5 vitamin, 100X 10 - Asp/Glu, 5mg/ml stock 10 - Timentin 0,05 g - Cefotaxime 0,1 g - Vancomycin 0.05 - Thêm nước đủ 20 ml Lọc vơ trùng
8. Mơi trường YEP
Hàm lượng (g/l)
Pepton 10,00
Yeast extract (cao nấm men) 5,00
NaCl 10,00
9. Cơng thức pha hĩa chất
- Hĩa chất chạy điện di:
TAE 1X: 4,84 g Tris – HCl 2 ml Na2EDTA 0,5M pH 8,0 1,14 ml Glacial acetic Thêm nước cất đủ 100 ml
Dung dịch nạp mẫu: 30% glycerol trong nước cất
0,25% xylen cyanol 0,25% bromophenol blue
- Dung dịch Liberty: 1% Basta
0,01% Tween
10. Kết quả xử lí thống kê
Title: Effect of MPN on eliminating Agrobacterium after co-
cultivation
Function: ANOVA-1 Data case no. 1 to 32
One way ANOVA grouped over variable 1 ( NT) with values from 1 to 8.