Kết quả cho thấy, khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê ở hiệu suất tái sinh chồi khi OD650 của dịch vi khuẩn đồng nuơi cấy là 0,4; 0,5 và 0,6. Hiệu suất tái sinh chồi ở các nghiệm thức lần lượt là 93,25%, 91,91% và 90,75% (bảng 3.4). Khi tăng nồng độ vi khuẩn, khảnăng tái sinh của mơ giảm, các mẫu khơng hình thành chồi thường tạo 1 khối mơ sẹo lớn, mặc khác ở các nồng độ vi khuẩn cao tỉ lệ mẫu tái nhiễm rất lớn.
Dịch vi khuẩn đạt OD650= 0,6 – 0,7 cho hiệu suất chuyển gen cao nhất (lần lượt là 64,10% và 59,35%), điều này cĩ thểđược giải thích dựa vào chu kỳ tăng trưởng của vi khuẩn và mật độ tiếp xúc của vi khuẩn với mẫu. Giai đoạn này vi khuẩn đang ở pha log, cĩ khả năng hoạt động và sinh sản tối ưu, do đĩ cho hiệu suất chuyển gen cao nhất. Ở những mật độ thấp, mặc dù cĩ hiệu quả tái sinh cao nhưng số mẫu kháng trên mơi trường chọn lọc thấp do mật độ tiếp xúc thấp.
Như vậy, một thơng số khác của quy trình chuyển gen trên đậu nành được ghi nhận là nồng độ vi khuẩn OD650= 0,6.
Hình 3. 9: Biểu đồảnh hưởng của thời gian đồng nuơi cấy lên hiệu quả chuyển gen
3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuơi cấy lên hiệu quả chuyển gen
Thời gian đồng nuơi cấy vi khuẩn với mẫu trên mơi trường cĩ bổ sung hợp chất phenolic Acetosyringone (AS) là giai đoạn quyết định của quá trình chuyển gen. Trong khoảng thời gian này, AS sẽ cảm ứng sự hoạt động của hệ thống gen vir của vi khuẩn để chuyển gen mục tiêu vào tế bào thực vật. Thời gian đồng nuơi cấy tối ưu khác nhau trên các loại cây khác nhau, do đĩ thí nghiệm này được thiết kế nhằm tìm ra sốngày đồng nuơi cấy thích hợp cho đối tượng là lá mầm đậu nành.
Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuơi cấy lên hiệu quả chuyển gen
Thời gian đồng nuơi cấy (ngày) % mẫu tái sinh % mẫu xanh 4 86,00a 50,13ab
5 91,15a 66,85a
6 76,48b 29,58b
ANOVA * *
CV 6,26% 28,66%
Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuơi cấy lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuơi cấy. Thanh ngang 2 cm. A – giai đoạn tái sinh, B – giai đoạn chọn lọc, C – giai
đoạn kéo dài ở lần cấy chuyền thứ 1
Mẫu sau khi được tạo vết thương, ủ 30 phút cùng với vi khuẩn sẽđược đặt gián tiếp lên mơi trường CC thơng qua một lớp giấy lọc vơ trùng. Phương pháp này làm giảm sự tiếp xúc của vi khuẩn với mơi trường, qua đĩ làm giảm sự phát triển vượt mức của chúng. Tuy nhiên, sự tiếp xúc với nước và chất dinh dưỡng của mẫu lá mầm cũng bị hạn chế. Do đĩ, mẫu sau khi đồng nuơi cấy 6 ngày thì sức sống, khả năng tái sinh giảm và hiệu suất biến nạp thấp (tái sinh 76,48%, mẫu xanh 29,58%).
Hiệu suất tái sinh chồi khơng cĩ sự khác biệt khi đồng nuơi cấy 4 hoặc 5 ngày về mặt thống kê, nhưng cĩ sự khác biệt về hiệu suất chuyển gen. Tỉ lệ
mẫu xanh trên mơi trường chọn lọc chỉ đạt 50,13% khi đồng nuơi cấy 4 ngày, đạt cao nhất 66,85% khi đồng nuơi cấy 5 ngày. Kết quả trên cho thấy, đồng nuơi cấy 5 ngày là thời gian tốt nhất cho chuyển gen hiệu quảtrên đậu nành.
3.7 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 sau khi
đồng nuơi cấy
3.7.1 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự phát triển của vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 timentin lên sự phát triển của vi khuẩn A. tumefaciens AGL1
Meropenem là kháng sinh cĩ phổ hoạt tính rộng, chống lại hầu hết vi khuẩn gram âm, gram dương và vi khuẩn kỵ khí. Giống như các loại kháng sinh β-lactam phân nhĩm carbapenem khác, meropenem ngăn chặn sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách thâm nhập qua màng tế bào và gắn chuyên biệt vào protein PBP (penicillin – binding protein) với ái lực cao và kết quả là gây chết tế bào [6], [75].
Thí nghiệm này được thiết kế nhằm đánh giá tính nhạy cảm của AGL1 với meropenem và meropenem kết hợp timentin. AGL1 được trải trên mơi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin bổ sung meropenem và meropenem kết hợp timentin với các nồng độ khác nhau để tìm ra ngưỡng tác động của 2 loại kháng sinh này lên vi khuẩn, từđĩ làm cơ sở để chọn ra nồng độ thích hợp cho thí nghiệm loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuơi cấy.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, meropenem ức chế sựtăng trưởng và giết chết tế bào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 ở nồng độ rất thấp. Vi khuẩn chỉ cĩ thể mọc sau 5 ngày trên mơi trường bổ sung 1 mg/l và sau 2 tuần trên 3 mg/l khi hoạt tính của kháng sinh đã giảm bớt theo thời gian. Vi khuẩn khơng cĩ khả năng mọc trên mơi trường bổ sung nồng độ từ 5 mg/l meropenem trở lên. Timentin ở nồng độ 50 mg/l khơng cĩ khả năng ức chế hồn tồn vi khuẩn, AGL1 cĩ thể mọc sau 5 ngày quan sát, việc kết hợp với meropenem đã làm gia tăng khảnăng giết chết vi khuẩn.
Hình 3. 11: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự phát triển của A. tumefaciens AGL1. Thanh ngang 2 cm; M: meropenem; T: timentin
Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự phát triển của A. tumefaciens AGL1 Kháng sinh Ngày nuơi cấy 1 3 5 7 14 28 32 Đối chứng + + + + + + + M1 mg/l - - + + + + + M3 mg/l - - - - + + + M5 mg/l - - - - - - - M10 mg/l - - - - - - - M15 mg/l - - - - - - - M20 mg/l - - - - - - - M25 mg/l - - - - - - - T50 mg/l + M0 mg/l - + + + + + + T50 mg/l + M5 mg/l - - - - - - - T50 mg/l + M10 mg/l - - - - - - - T50 mg/l + M25 mg/l - - - - - - -
Như vậy, meropenem 5 mg/l cĩ khả năng ức chế và gây chết hồn tồn tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens AGL1. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trên chủng Agrobacterium tumefaciens EHA101 (số liệu khơng được thể hiện trong báo cáo này).
3.7.2 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu chuyển gen qua timentin lên sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu chuyển gen qua
các giai đoạn nuơi cấy
Việc loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuơi cấy trong các quy trình chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens là cơng việc cần thiết nhằm tạo điều kiện cho thể chuyển gen được phát triển thuận lợi nhất. Sự phát triển vượt mức của vi khuẩn hiện diện sẽ cạnh tranh về mặt dinh dưỡng và cĩ ảnh hưởng bất lợi lên mẫu cấy. Việc sử dụng kết hợp cả ba loại kháng sinh là cefotaxime 100 mg/l, timentin 50 mg/l và vancomycin 50 mg/l trong giai đoạn rửa và 3 giai đoạn nuơi cấy sau khi xâm nhiễm (tạo chồi, chọn lọc, kéo dài chồi) đã được tiến hành trong hầu hết các quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens trên đậu nành (Margie M. Paz và cộng sự, 2004; Zhang và cộng sự, 1999…). Hiệu quả của sự kết hợp này đã được ghi nhận dựa trên khả năng loại bỏ hồn tồn vi khuẩn ra khỏi mơi trường nuơi cấy, sự kết hợp tăng cường khả năng giết chết vi khuẩn đồng thời làm giảm ảnh hưởng cĩ hại lên mơ thực vật do việc giảm nồng độ mỗi loại kháng sinh sử dụng. Tuy nhiên, vancomycin là loại kháng sinh cĩ giá thành rất cao, do đĩ việc tìm ra một loại chất kháng khuẩn cĩ hiệu quả ở nồng độ thấp và ít gây hại cho mơ thực vật để thay thế nhằm nâng cao hiệu suất chuyển gen và cĩ ý nghĩa về mặt kinh tế là vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu.
Meropenem là loại kháng sinh cĩ hoạt tính mạnh, đã được sử dụng trong các quy trình chuyển gen trên thuốc lá, cà chua và lúa với nồng độ thấp từ 6,25 – 25 mg/l [30], với PLB lan HồĐiệp là 5 mg/l trên mơi trường lỏng tĩnh và 15 mg/l trên mơi trường rắn [1]…Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành thử nghiệm hiệu quả của meropenem trong chuyển gen trên đậu nành.
Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn qua các giai đoạn nuơi cấy của quá trình chuyển gen
Kháng sinh
Giai đoạn tạo chồi Giai đoạn chọn lọc % mẫu tái sinh % mẫu nhiễm % mẫu xanh % mẫu nhiễm T50+V50+C100 85,05 0,00b 58,00ab 0,00c T50+M5 85,00 0,45b 59,83ab 0,00c T50+M10 82,10 0,00b 62,13a 0,00c M5 87,40 12,50a 45,28bc 96,79a M10 86,75 0,98b 54,60ab 20,80b M15 85,70 0,00b 54,20ab 1,03c M20 85,03 0,00b 55,25ab 0,00c M25 77,80 0,00b 38,18c 0,00c ANOVA ns ** * ** CV 14,35% 258,52% 20,94% 19,90%
**: Kết quả giữa các nghiệm thức cĩ mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0.01 *: Kết quả giữa các nghiệm thức cĩ mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0.05 ns: Kết quả giữa các nghiệm thức khơng cĩ sự khác biệt
Hình 3. 12: Biểu đồảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuơi cấy
Hình 3. 13: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏA.
tumefaciens ra khỏi mẫu qua các giai đoạn nuơi cấy. Thanh ngang 2 cm. A: giai đoạn tạo chồi; B: giai đoạn chọn lọc chồi; C: giai đoạn kéo dài chồi ở lần cấy chuyền 1. T50: Timentin 50 mg/l; V50: vancomycin 50 mg/l; C100: cefotaxime 100 mg/l; M5: meropenem 5 mg/l; M10: meropenem 10 mg/l; M15: meropenem 15 mg/l; M20: meropenem 20 mg/l; M25: meropenem 25 mg/l
Các nghiệm thức được bố trí dựa vào kết quả của thí nghiệm 3.7.1, meropenem 5 mg/l ức chế hồn tồn sự phát triển của A. tumefaciens AGL1. Meropenem và meropenem kết hợp với timentin với nồng độ khác nhau từ 5 mg/l trở đi được sử dụng làm tác nhân diệt khuẩn trong các mơi trường nuơi cấy ở tất cả giai đoạn của quy trình: mơi trường rửa khuẩn, mơi trường cảm ứng tạo chồi SI khơng cĩ glufosinate, mơi trường chọn lọc SI + 10 mg/l glufosinate và mơi trường kéo dài chồi SE + 4 mg/l glufosinate (bảng 3.7).
Kết quả cho thấy, kết hợp meropene 10 mg/l với timentin 50mg/l cho hiệu quả chuyển gen cao nhất đồng thời ức chế hồn tồn sự phát triển của vi khuẩn (bảng 3.7). Khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê được ghi nhận về khả năng tái sinh chồi giữa các nghiệm thức. Tuy nhiên, cĩ sự khác biệt rất lớn về tỉ lệ chồi kháng trên mơi trường chọn lọc cũng như sự sống sĩt của chồi trên mơi trường kéo dài chồi SE. Điều này cĩ nghĩa rằng, sử dụng kháng sinh với các nồng độ khác nhau khơng ảnh hưởng lên sự tái sinh chồi của mẫu, nhưng lại cĩ tác động lớn đến khảnăng sống sĩt của mẫu cấy, nồng độ kháng sinh càng cao càng bất lợi lên sựtăng trưởng của mẫu cấy. Ở nồng độ thấp của meropenem (5 – 10 mg/l), sự tái nhiễm khuẩn được ghi nhận. Nồng độ 20 – 25 mg/l meropenem cĩ tác dụng ngăn chặn hồn tồn vi khuẩn qua tất cảgiai đoạn nuơi cấy, tuy nhiên hiệu quả biến nạp giảm do chồi trên mơi trường bị ức chế và chết (hình 3.13).
3.8 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm
Các chồi cao từ 3 – 5 cm trên mơi trường SE (hình 3.14 A) được thu nhận và chuyển sang mơi trường ra rễ. Khi cây con cĩ rễ hồn chỉnh, chúng sẽ được trồng trong phịng tăng trưởng 3 - 4 tuần và sau đĩ chuyển ra nhà kính.
Chồi được ngâm trong dung dịch IBA 1 mg/l 3 phút trước khi chuyển sang mơi trường MS cho hiệu quả tạo rễ tốt, 100% chồi cĩ rễ hồn chỉnh chỉ sau 10 – 14 ngày (hình 3.14 C). Cây con từ mơi trường in vitro được trồng trong các hộp Magenda, đậy nắp để giảm mạnh sự thốt hơi nước, giúp chúng cĩ tỉ lệ sống cao trong giai đoạn mới ra vườn ươm (hình 3.15 A, B).
Hình 3. 14: Chọn lọc chồi và ra rễin vitro. A: chồi cao từ 3 – 5 cm trên mơi trường kéo dài chồi bổ sung 4 mg/l glufosinate; B: Chồi cấy trên mơi trường RM; C: ra rễtrên mơi trường RM
Kết quả, 52 dịng cây chuyển gen được thu nhận trên tất cả thí nghiệm cĩ sức sống tốt, tỉ lệ sống ngồi vườn ươm là 96,15%. Kết quả ghi nhận ban đầu cho thấy, cĩ sự khác biệt về chiều cao giữa các dịng cây chuyển gen.
Sau khoảng 2 tuần trong phịng tăng trưởng, cây cĩ đầy đủ 3 lớp lá để thực hiện thử nghiệm leaf – painting. Các cây kháng với Liberty sẽ được chuyển sang các chậu cĩ đường kính lớn hơn và đặt trong nhà kính (hình 3.16). Maverick là giống đậu nành thân leo, do đĩ cần cĩ giàn để cây phát triển tốt bộ lá trước khi đến giai đoạn ra hoa, tạo trái.
Hình 3. 15: Cây đậu nành chuyển gen trong phịng tăng trưởng. A: Trồng cây con trong các chậu cĩ đường kính 60 mm; B: Các chậu cây con trong hộp Magenda đậy nắp; C: Cây con 1 tuần trong phịng tăng trưởng; D: Cây con 2 tuần trong phịng tăng trưởng; D: Cây con 3 tuần
Hình 3. 16: Cây đậu nành chuyển gen sau 15 ngày chuyển ra nhà kính
3.9 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngồi vườn ươm
bằng phương pháp leaf – painting
Sau khi cĩ cây chuyển gen in vitro, việc tiến hành thử nghiệm ex vitro
ngồi vườn ươm là cần thiết nhằm loại bỏ các cây escape và chọn lọc nhanh các cá thể mang gen chuyển ổn định trước khi kiểm định bằng phương pháp sinh học phân tử đắt tiền. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp leaf – painting với Liberty thường được sử dụng trong các quy trình chuyển gen để kiểm tra sự hiện diện của gen bar ngồi vườn ươm đã được loại trừ rất nhiều thểescape vượt qua giai đoạn chọn lọc in vitro [8].
Cĩ 23 dịng cây trong số 52 dịng chuyển gen giả định được chọn để thực hiện leaf – painting. Kết quảnhư sau:
- Cĩ 9 cây kháng, lá vẫn xanh tốt và khơng cĩ bất cứ biểu hiện thương tổn nào sau ba lần thử với Liberty (hình 3.17 A). Đây là những cá thểđã được chuyển gen và cĩ sự biểu hiện gen chuyển một cách ổn định.
- Cĩ 5 cây phản ứng nhạy với Liberty qua cả 3 lần thử nghiệm, các vùng lá xung quanh vị trí được bơi Liberty bị vàng úa, hĩa nâu và sau đĩ rụng (hình
Hình 3. 17: Thử nghiệm leaf – painting ngồi vườm ươm. Thanh ngang 3 cm. R: kháng; S: nhạy. A: cây R – R – R; B: cây R – R – S; C: cây R – S – S; D: cây: S – S – S. A: cây R – R – R; B: cây R – R – S; C: cây R – S – S; D: cây: S – S – S.
3.17 D). Đây là các cây escape đã vượt qua quá trình chọn lọc bằng glufosinate trong điều kiện in vitro.
- Cĩ 6 cây kháng 2 lần và nhạy 1 lần (R-R-S), 3 cây R-S-S kháng 1 lần và nhạy 2 lần (hình 3.17 B, C). Đây cĩ thể là các cây ở dạng thể khảm (chỉ cĩ 1 phần nào đĩ của cây được chuyển gen), hoặc là cây đã được chuyển gen hoàn tồn nhưng gen chuyển đã được sát nhập vào vùng ít hoạt động trên genome.
3.10 Tách chiết DNA cây chuyển gen giảđịnh và kiểm tra sự hiện diện của