2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.8Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem
2.2 Phương pháp
2.2.8Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem
khi đồng nuơi cấy
2.2.8.1 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự phát triển của vi khuẩn A. tumefaciens AGL1
2.2.8.1.1 Mục tiêu
Xác định nồng độ meropenem và meropenem kết hợp với timentin tối thiểu gây chết hồn tồn vi khuẩn A. tumefaciens AGL1.
2.2.8.1.2 Phương pháp
- Ria vi khuẩn AGL1 trên mơi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin, ủ 28oC, 48 giờ.
- Huyền phù 1 khuẩn lạc trong 1 ml YEP, lắc 250 rpm, 28oC, 1 giờ.
- Trải 100 µl dịch huyền phù lên đĩa mơi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin cĩ bổ sung:
+ Meropenem với các nồng độ: 0, 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 mg/l.
+ Timentin 50 mg/l và meropenem với các nồng độ: 0, 5, 10, 25 mg/l. - Nuơi cấy ở 28oC.
Mỗi nghiệm thức 1 đĩa, lặp lại 2 lần.
2.2.8.1.3 Chỉ tiêu theo dõi
Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên mơi trường cĩ kháng sinh trong 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 32 ngày.
2.2.8.2 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu chuyển gen qua
các giai đoạn nuơi cấy 2.2.8.2.1 Mục tiêu
- Xác định nồng độ meropenem và meropenem kết hợp với timentin tối thiểu loại bỏ hồn tồn vi khuẩn ra khỏi mẫu cấy qua các giai đoạn của quá trình chuyển gen.
- Xác định ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự phát triển của chồi qua các giai đoạn của quá trình chuyển gen.
2.2.8.2.2 Phương pháp
- Chuẩn bị vi khuẩn như mục 2.2.2.1, OD650 = 0,6.
- Chọn các lá mầm 5 ngày tuổi làm vật liệu nuơi cấy. Phương pháp tạo vết thương và ủ chung với vi khuẩn tương tự mục 2.2.3.2, thời gian đồng nuơi cấy 5 ngày.
- Các nghiệm thức dùng kháng sinh để diệt khuẩn trong mơi trường rửa, tạo chồi, chọn lọc và kéo dài là:
+ Timentin 50 mg/l + vancomycin 50 mg/l + cefotaxime 100 mg/l (đối chứng). + Timentin 50 mg/l + meropenem 5 mg/l. + Timentin 50 mg/l + meropenem 10 mg/l. + Meropenem 5 mg/l. + Meropenem 10 mg/l. + Meropenem 15 mg/l. + Meropenem 20 mg/l. + Meropenem 25 mg/l.
- Phương pháp rửa, tạo chồi, chọn lọc chồi và kéo dài chồi tương tự như mục 2.2.3.
Mỗi nghiệm thức 25 mẫu, lặp lại 4 lần.
2.2.8.2.3 Chỉ tiêu theo dõi
- Phần trăm số mẫu nhiễm A. tumefaciens qua các giai đoạn: tạo chồi và chọn lọc.
- Phần trăm số mẫu tái sinh chồi.
- Phần trăm số mẫu xanh tốt trên mơi trường chọn lọc.