4.1 Kết luận
Với kết quả thu được như trên, luận văn đã thành cơng trong việc chuyển plasmid pZY 101 – Tnt1 nhờ Agrobacterium tumefaciens AGL1 vào cây đậu nành Glycine max giống Maverick. Một số thơng số của quá trình chuyển nạp được tối ưu như sau:
- Khẳng định cassette mang gen chuyển cĩ gen Tnt1.
- Chuyển thành cơng plasmid mang gen Tnt1 và bar với các thơng số: + Lá mầm 5 ngày tuổi
+ Thời gian đồng nuơi cấy 5 ngày
+ Nồng độ vi khuẩn OD650= 0,6.
- Tác nhân chọn lọc thể chuyển gen là glufosinate nồng độ 10 mg/l. - Meropenem 10 mg/l kết hợp với timentin 50 mg/l cĩ thể thay thế
cefotaxime và vancomycine trong quá trình loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuơi cấy.
- 52 dịng chuyển gen cĩ sức sống tốt, tỉ lệ sống ngồi vườn ươm
96,15%.
- Kết quả leaf-painting: 9 cây R-R-R, 6 cây R-R-S, 3 cây R-S-S và 5 cây S-S-S.
- Tín hiệu PCR dương tính được ghi nhận ở tất cả cây kháng nhưng khơng cĩ ở các cây nhạy.
Hình 4. 1: Quy trình chuyển gen trên đậu nành bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens.
1: Khử trùng hạt, 16 giờ; 2: Gieo hạt, 5 ngày; 3: Tạo vết thương và đồng nuơi cấy với A. tumefaciens, 5 ngày; 4: Tạo chồi trên mơi trường SI khơng cĩ glufosinate, 2 tuần; 5: Chọn lọc chồi trên mơi trường SI bổ sung 10 mg/l glufosinate, 2 tuần; 6: Kéo dài chồi trên mơi trường SE bổ sung 4 mg/l glufosinate, cấy chuyền 2 tuần / lần; 7: Ra rễ, 10 – 14 ngày; 8: Ra vườn ươm; 9: Kiểm tra cây chuyển gen bằng phương pháp leaf – painting, PCR.
Trên cơ sở các kết quả thu được, các hướng nghiên cứu tiếp theo cần được triển khai nhằm hoàn thiện quy trình và đưa ra ứng dụng:
- Tiếp tục thu nhận các chồi chuyển gen giả định, trồng và thử nghiệm leaf – painting để tính hiệu suất chuyển gen.
- Thực hiện các phương pháp phân tích kiểu hình trên cây đậu nành chuyển gen nhằm đánh giá tác động của retrotransposon Tnt1.
- Khảo sát sự di truyền và tính đa hình của gen Tnt1 bằng phương pháp lai Southern Blot qua các thế hệ.
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT