1.3.1 Phương pháp bắn gen
Bắn gen là một phương pháp cĩ vai trị quan trọng để thực hiện chuyển gen trên thực vật, nhất là cây một lá mầm và những cây khĩ hoặc khơng đáp ứng lại với Agrobacterium. Phương pháp này do giáo sư John Stanford, đại học Cornell (Mỹ) phát minh đầu tiên vào năm 1987.
Nguyên tắc chung của phương pháp bắn gen là sử dụng các vi đạn cĩ kích thước hiển vi tỷ trọng cao đểđạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngồi tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. Ngày nay bắn gen trở thành một kỹ thuật duy nhất đáng tin cậy để chuyển gen vào các bào quan như nhân, ty thể, lục lạp. Ưu điểm của bắn gen so với các phương pháp khác là đơn giản và nhanh chĩng, phù hợp cho các nghiên cứu biểu hiện gen. Vùng mơ đích để chuyển gen bằng phương pháp này cũng rất đa dạng và thành cơng trên nhiều đối tượng thực vật như phơi sinhdưỡng, phơi sinh dục cịn non (đu đủ, đậu nành), phơi trong dịch treo tế bào (bơng vải, thuốc lá, bắp, lúa miến), đỉnh sinh trưởng, lớp mỏng tế bào, mơ sẹo (thuốc lá), phơi từ mơ sẹo (gỗ vân sam Norway, bắp, đu đủ), lát cắt đỉnh sinh trưởng và lá (thuốc lá, đu đủ)…[35].
1.3.2 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium-mediated
transformation)
Đây là phương pháp biến đổi dựa trên phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn A. tumefaciens. Người ta xử lý mơ cấy bằng sĩng siêu âm trong một thời gian ngắn với sự hiện diện của A. tumefaciens. Sĩng siêu âm sẽ tạo ra rất nhiều vết thương nhỏ và đồng đều trên mơ cấy, cho phép A. tumefaciens xâm nhiễm dễdàng, và do đĩ làm tăng hiệu quả biến nạp. Đây là phương pháp khá hữu hiệu, đơn giản và rẻ tiền, làm gia tăng hiệu quả biến nạp gen gián tiếp đối với những cây cĩ hiệu suất chuyển gen thấp [41].
Một số cơng trình chuyển gen sử dụng phương pháp SAAT đã được cơng bố: Miller và cộng sự, 1974 (mơ rễ cây Vicia faba); Joersbo và Brunstedt, 1990 (protoplast của Nicotiana tabacum và Beta vulgaris); Trick và Finer,
1997 (đậu nành, lúa mì, bắp); Ning Han và cộng sự, 2005 (mơ sẹo Agrotis stolonifera var. palustris…
1.3.3 Phương pháp lọc chân khơng
Phương pháp lọc chân khơng đã được áp dụng trên một số loại cây, đặc biệt là cây một lá mầm. Người ta đặt mơ cấy và dịch vi khuẩn A. tumefaciens
vào trong một mơi trường chân khơng (nhờ máy hút) nhờ vậy vi khuẩn cĩ thể bám chặt trên tồn bộ bề mặt mơ mẫu, hiệu quả biến nạp vì thế cũng tăng lên. Phương pháp này đã được cơng bố trên cây Medicago truncatula (Trieu và cộng sự, 2000) [41].
1.3.4 Phương pháp Floral-dip
Ở phương pháp này, cây chuyển gen được tạo ra bằng cách ngâm hoa trực tiếp vào dịch vi khuẩn A. tumefaciens. Ưu điểm của phương pháp Floral- dip là khơng cần phải nuơi cấy in vitro, do đĩ cĩ thể loại trừ nguy cơ biến dị soma (Clough và cộng sự, 1998). Sau đĩ, phương pháp này cịn thành cơng trên cây Arabidopsis thaliana với mơ mục tiêu là hạt và hạt phấn của hoa chưa trưởng thành (Ye và cộng sự, 1999; Desfeux và cộng sự, 2000) [41].
1.3.5 Phương pháp Agrolistic
Agrolistic là sự kết hợp các tiện ích như: cĩ hiệu quả cao trên rất nhiều lồi cây của phương pháp bắn gen và hệ thống chuyển gen chính xác của A. tumefaciens nhờ T-DNA. Phương pháp này sẽ khắc phục được giới hạn phạm vi ký chủ của A. tumefaciensđồng thời cĩ thể kiểm sốt số bản sao và vùng gen được chèn vào tế bào thực vật, làm giảm đến mức tối thiểu các trình tự tương đồng cĩ thể làm mất ổn định di truyền về sau. Người ta thiết kế một cassette biểu hiện trong thực vật cho gen virD1 và virD2 sau đĩ đồng bắn gen với một vector chứa gen mục tiêu cĩ hai lề là trình tự lề trái và lề phải của T-DNA. Sản phẩm của virD1 và virD2 cĩ thể cắt hai lề của T-DNA trong tế bào thực vật, tạo ra thể biến nạp cĩ chèn vùng T-DNA chứa gen mục tiêu mong muốn [17], [41].
1.3.6 Vi tiêm DNA
Vi tiêm là phương pháp tiêm trực tiếp DNA vào nhân của tế bào phơi đơn. Phương pháp này địi hỏi trang thiết bị kỹ thuật đắt tiền cho việc vi thao
tác dưới kính hiển vi và sự khéo léo, chính xác để tiêm một lượng rất nhỏ dung dịch DNA. Tế bào đơn được cố định dưới đáy ống thủy tinh bằng áp lực thấp và DNA được tiêm vào nhân bằng micropipette thủy tinh mỏng. Tế bào vi tiêm sau đĩ sẽ được nuơi cấy in vitro để tái sinh thành cây (Neuhaus và cộng sự, 1987) [41].
1.3.7 Vi sợi "whiskers"
Phương pháp này liên quan đến việc sử dụng vi sợi "whiskers" (giống như cây kim rất nhỏ với 2 đầu nhọn). Mơ cấy, dung dịch DNA gen mục tiêu và whiskers được huyền phù trong một cái ống, sau đĩ lắc mạnh. Các whiskers sẽ đâm vào mơ cây (nhưng khơng làm chết chúng), tạo điều kiện cho việc phĩng thích gen mục tiêu vào nhân tế bào thực vật (Wang và cộng sự, 1995) [41].
1.3.8 Phương pháp PEG (Polyethylene glycol)
Trong phương pháp PEG, PEG đĩng vai trị là nhân tố kích hoạt sự dung hợp tế bào trần với gen lạ(dưới dạng plasmid DNA). Phương pháp PEG cho hiệu suất biến nạp rất thấp (khoảng 1%). Tuy nhiên, do cĩ thể thực hiện trên một sốlượng tế bào cực lớn và nếu cĩ hệ thống chọn lọc hiệu quả, người ta cũng thu được cây chuyển gen (Zhang và Wu, 1998) [2].
1.3.9 Phương pháp xung điện
Phương pháp xung điện được đánh giá là hiệu quả và ít gây hại cho tế bào trần hơn PEG. Tế bào trần được trộn với dung dịch DNA và xử lý với xung điện ngắn để tạo ra các lỗđàn hồi trên màng plasma, nhờ vậy DNA dễdàng đi vào trong tế bào. Một số cơng trình đã cơng bố: Akella & Lurquin, 1993 (Đậu đũa); Songstad và cộng sự, 1993 (Zea mays); Xu & Li, 1994; Rao, 1995 (Oryza sativa); Dillen và cộng sự, 1995 (Phaseolus vulgaris) [2], [41].