2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2 Phương pháp
2.2.3 Các bước thực hiện quy trình chuyển gen bằng A tumefaciens
mẫu lá mầm cây đậu nành
2.2.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn
- Ria vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 mang plasmid pZY 101 – Tnt1 trên mơi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin, ủ 28oC, 48 giờ.
- Chọn 4 – 5 khuẩn lạc đơn nuơi cấy trong ống falcon 15 ml chứa 2 ml mơi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin lỏng, lắc 250 rpm, 28oC, 8 giờ.
Hình 2. 3: Quy trình tạo vết thương trên vùng nốt lá mầm [50]
- Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn vào trong erlen chứa 200 ml mơi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin lỏng, lắc 250 rpm qua đêm, 28oC sao cho nồng độ vi khuẩn đạt OD650 cần cho thí nghiệm. - Chia đều dịch nuơi cấy vào các ống falcon 50 ml, ly tâm 3500 rpm, 10
phút thu sinh khối.
- Pha lỗng sinh khối vi khuẩn bằng mơi trường CC lỏng sao cho nồng độ vi khuẩn đạt OD650 cần cho thí nghiệm.
2.2.3.2 Tạo vết thương và đồng nuơi cấy vi khuẩn với mẫu lá mầm đậu nành (Zhang và cộng sự, 1999) (hình 2.3, 2.4)
- Vật liệu ban đầu là các lá mầm xanh tốt, vơ trùng, với độ tuổi phụ thuộc vào từng thí nghiệm.
- Cho 30 ml dịch vi khuẩn đã pha lỗng vào mỗi đĩa petri (20 x 100 mm). - Cắt phần tử diệp ra khỏi rễ tại vùng trục hạ diệp.
- Tách rời 2 tử diệp bằng cách cắt dọc qua vùng trục hạ diệp, loại bỏ vùng thượng diệp và chồi sơ cấp (hình 2.3).
- Nhúng đầu mũi dao vào dịch vi khuẩn sau đĩ tạo 7 – 8 vết cắt song song (sâu 0,5 mm dài 3 - 4 mm) tại vùng nốt lá mầm (cotyledonary node).
- Cho 50 mẫu lá mầm đã tạo vết thương vào mỗi đĩa vi khuẩn sao cho tất cả mẫu ngập hồn tồn trong dung dịch, ủ 30 phút.
- Cho 1 tờ giấy lọc vơ trùng đường kính 70 mm lên bề mặt mơi trường đồng nuơi cấy CC.
Hình 2. 5: Mẫu lá mầm đậu nành sau khi ủ chung với vi khuẩn trên mơi trường đồng nuơi cấy. Thanh ngang 2 cm
Hình 2. 4: Khuẩn lạc A. tumefaciens AGL1 mang plasmid pZY 101 – Tnt1 trên mơi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin. Thanh ngang 2 cm
- Sau 30 phút, đặt úp 5 mẫu lá mầm lên mỗi đĩa mơi trường CC sao cho mẫu nằm hồn tồn trong tờ giấy lọc (hình 2.5), ủ ở 24oC, quang kỳ 18 giờ.
- Thời gian đồng nuơi cấy mẫu với vi khuẩn phụ thuộc vào các thí nghiệm.
2.2.3.3 Rửa với kháng sinh để loại vi khuẩn sau khi đồng nuơi cấy và tái sinh chồi
- Chuẩn bị mơi trường rửa vi khuẩn: mơi trường SI lỏng bổ sung 100 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timentin + 50 mg/l vancomycin, đổ 25 ml mơi trường / đĩa petri vơ trùng đường kính 10 mm.
- Rửa nhẹ nhàng các mẫu lá mầm sau đồng nuơi cấy trong mơi trường rửa bằng kẹp vơ trùng, 25 mẫu / đĩa mơi trường rửa.
- Cấy ngửa 5 mẫu trên mỗi đĩa mơi trường SI rắn (khơng cĩ glufosinate) bổ sung 100 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timentin + 50 mg/l vancomycin sao cho vùng nốt lá mầm ngập hồn tồn vào mơi trường.
- Nuơi cấy ởđiều kiện 24oC, quang kỳ 18h, 14 ngày.
2.2.3.4 Chọn lọc chồi chuyển gen
- Sau 14 ngày trên mơi trường cảm ứng tạo chồi SI khơng cĩ glufosinate, chọn các mẫu cĩ xuất hiện chồi.
- Cắt bỏ cẩn thận chồi sơ cấp và phần tạo sẹo ở mặt dưới lá mầm tránh làm tổn thương các chồi nhỏ, cấy mẫu lên mơi trường cảm ứng tạo chồi cĩ bổ sung 10 mg/l glufosinate sao cho phần mặt cắt ngập trong mơi trường.
- Nuơi cấy 14 ngày, 24oC, quang kỳ 18 giờ.
2.2.3.5 Kéo dài chồi chuyển gen
- Sau 14 ngày trên mơi trường chọn lọc, chọn các mẫu cĩ chồi cịn sống. - Cắt bỏ phần lá mầm, phần mơ sẹo ở gốc chồi, nhẹ nhàng bỏ các chồi
chết mà khơng làm tổn thương các chồi xanh cịn lại.
- Cấy mẫu lên mơi trường kéo dài chồi SE cĩ bổ sung 4 mg/l glufosinate. - Cấy chuyền sang mơi trường mới 2 tuần/lần.