3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Tách chiết plasmid pZY 10 1– Tnt1và kiểm tra sự hiện diện của Tnt
bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn
Plasmid sau khi tách chiết được định lượng và kiểm tra độ tinh sạch bằng máy Nano Drop (bảng 3.1). Tỉ lệ OD260/OD280 của 2 mẫu nằm trong khoảng 1,8 – 2,0, do đĩ plasmid thu được là tinh sạch.
Bảng 3. 1: Kết quảđo NanoDrop plasmid pZY 101 – Tnt1
Mẫu OD260/OD280 Nồng độ (ng/µl)
pZY 101 – Tnt1 1 1,91 3601,20
pZY 101 – Tnt1 2 1,90 3289,14
Quan sát kết quả điện di (hình 3.1) ta thấy, cả 2 mẫu plasmid đều nguyên vẹn và cĩ kích thước khoảng 14,1 kb so với thang chuẩn λ, đây là kích thước của plasmid pZY 101 đã được chèn Tnt1. Ở giếng plasmid cắt với enzyme EcoRI, sự xuất hiện của 2 vạch tương ứng 9,1 kb và 5 kb so với thang
Hình 3. 2: Hạt đậu nành giống Maverick đã khử trùng (A) và nảy mầm 5 ngày trên mơi trường GM (B). Thanh ngang 2 cm
chuẩn 1 kb cho thấy cĩ đoạn gen khoảng 5 kb (tương ứng với kích thước của đoạn gen Tnt1) được chèn vào vị trí enzyme EcoRI.
Kết quả trên khẳng định cả 2 dịng khuẩn lạc được chọn đều mang plasmid pZY 101 cĩ chứa đoạn gen mã hĩa Tnt1. Do đĩ, cĩ thể sử dụng 2 dịng vi khuẩn này làm vật liệu cho các thí nghiệm chuyển gen tiếp theo.
3.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành
Phương pháp khử trùng bằng khí (gas sterilization) được sử dụng rộng rãi đối với các loại mẫu là hạt khơ. Khí thường được sử dụng là chlorine (dung dịch chlorox kết hợp với HCl nồng độ cao) hoặc formaldehyde. Phương pháp này cĩ nhiều ưu điểm: dễ thao tác, tiết kiệm thời gian, tỉ lệ nhiễm thấp, ít gây hại cho mẫu, đồng thời hạt sau khi được khử trùng ở dạng khơ ráo cĩ thể lưu trữ trong thời gian dài. Tuy nhiên, khí sử dụng trong phương pháp này rất độc hại do đĩ thí nghiệm cần phải được thực hiện trong tủ hút vơ trùng.
Hạt đậu nành dùng cho thí nghiệm được khử trùng bằng khí chlorine trong vịng 16 giờ cho tỉ lệ nhiễm khơng đáng kể. Sau 1 ngày gieo trên mơi trường, hạt bắt đầu trương nước. Vào ngày thứ 2, 100% hạt nảy mầm và tạo rễ. Trục hạ diệp kéo dài và lá mầm xanh bắt đầu tách vỏ vào ngày thứ 4. Sau 6 ngày, trục thượng diệp kéo dài và chồi đỉnh bắt đầu vươn cao.
Như vậy, lá mầm của hạt gieo trên mơi trường nảy mầm từ 4 – 6 ngày là đạt yêu cầu làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm chuyển gen tiếp theo.