3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen
sung glufosinate với nồng độ thay đổi từ 0 – 14 mg/l trong vịng 2 tuần (hình 3.4) cho thấy:
- Tác dụng gây chết của glufosinate bắt đầu được ghi nhận chỉ sau 1 tuần nuơi cấy. Tỉ lệ chồi non chết tăng dần tương ứng với sự tăng dần của lượng thuốc diệt cỏ.
- Mẫu đối chứng trên mơi trường khơng cĩ glufosinate sau 2 tuần vẫn xanh tốt, một số chồi con mới cũng được hình thành.
- Ở các nghiệm thức 2 – 4 mg/l, một số chồi vẫn sống nhưng khơng khỏe mạnh và khơng cĩ chồi mới xuất hiện. Ở nghiệm thức 6 – 8 mg/l glufosinate, cĩ 82,67 – 90% số chồi hĩa nâu và chết, số chồi cịn lại đều vàng úa.
- Các chồi trên mơi trường cĩ glufosinate từ 10 – 14 mg/l cĩ hiện tượng hố vàng, nâu và chết hồn tồn sau 2 tuần nuơi cấy.
Như vậy 10 mg/l là nồng độ glufosinate tối thiểu gây chết hồn tồn chồi chưa chuyển gen, các thí nghiệm chọn lọc về sau sẽ sử dụng nồng độ này.
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen gen
Các lá mầm trên mơi trường tạo chồi bắt đầu phồng lên và tăng kích thước sau khoảng 3 ngày, đặc biệt là tại vùng được tạo vết thương. Đối với mẫu lá mầm 6 ngày tuổi, đầu của lá mầm thường bị nứt và vàng hĩa. Quan sát trên tất cả các nghiệm thức, cụm chồi xuất hiện quanh vùng nốt lá mầm, được biệt hĩa gián tiếp trong vịng 10 ngày thơng qua giai đoạn mơ sẹo (hình 3.7 A).
Hiệu suất chồi tái sinh trên mơi trường tạo chồi khơng cĩ glufosinate thay đổi ởcác giai đoạn tuổi lá mầm khác nhau, sự khác biệt này rất cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 3.3). Kết quả về ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu suất tái sinh chồi cho thấy, mẫu từ lá mầm 5 ngày tuổi cho hiệu suất tái sinh cao nhất (91,2%), mẫu từ lá mầm 6 ngày cũng tạo chồi với % tương tự (85,2%). Mẫu tương đối cịn non từ lá mầm 4 ngày tuổi, rất dễ bị thương qua
các thao tác do lớp vỏ vẫn cịn bọc quanh phần lá mầm cho tỉ lệ tạo chồi thấp chỉ 59,2% (hình 3.6 A).
Tác động của tuổi lá mầm lên khả năng tái sinh chồi cũng đã được nghiên cứu ở các loại cây 2 lá mầm khác, ví dụ: dưa hấu (Zhuo và cộng sự, 1991; Kathal và cộng sự, 1988…). Sự hình thành chồi cũng như ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên sự tái sinh chồi tại vùng nốt lá mầm cĩ thể là do hoạt động sinh lý và phân chia mạnh của vùng này, rất dễ bị tác động bởi các yếu tố mơi trường đặc biệt là hormone ngoại sinh [10].
Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành
Tuổi lá mầm (ngày) % mẫu tái sinh % mẫu xanh
4 59,20b 46,40b
5 91,20a 67,75a
6 85,20a 51,65b
ANOVA ** *
CV 8,9% 15,34%
Hình 3. 5: Biểu đồảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành ngày
**: Kết quả giữa các nghiệm thức cĩ mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0.01 *: Kết quả giữa các nghiệm thức cĩ mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0.05
Hình 3. 6: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuơi cấy: A – giai đoạn tái sinh, B – giai đoạn chọn lọc, C – giai đoạn kéo dài lần ở cấy chuyền thứ 1, D –
Hình 3. 7: Chồi trên mơi trường SI khơng glufosinate (A) và cĩ 10 mg/l glufosinate (B) quan sát dưới kính lúp. Thanh ngang 0,2 cm. Mũi tên đỏ hình A chỉ cụm chồi được hình thành tại vùng nốt lá mầm; mũi tên đỏ hình B chỉ các chồi bị chết dưới tác dụng của glufosinate
Sự khác biệt về số lượng mẫu xanh tốt trên mơi trường chọn lọc cũng được ghi nhận giữa các nghiệm thức tuổi lá mầm. Glufosinate ở nồng độ 10 mg/l được bổsung vào giai đoạn này để chọn lọc các chồi chuyển gen, các chồi khơng được chuyển gen sẽ chết (hình 3.7 B). Quan sát các nghiệm thức cho thấy, hầu hết các chồi chết là các chồi lớn trong cụm, đây cĩ thể là các chồi sơ cấp hoặc là những chồi được hình thành đầu tiên chưa được chuyển gen (hình 3.6 B).
Tỉ lệ chồi xanh đạt cao nhất với các mẫu cĩ nguồn gốc từ lá mầm 5 ngày tuổi (67,75%), đối với mẫu từ lá mầm 6 ngày tuổi tỉ lệ này là 51,65% và lá mầm 4 ngày tuổi là 46,40%. Như vậy, lá mầm 5 ngày tuổi cĩ khả năng tái sinh chồi cao nhất và do đĩ cĩ hiệu suất chuyển gen cao nhất. Kết quả này cũng tương tự như một số các nghiên cứu về chuyển gen đậu nành trên thế giới (Zhang, 1999; Paula, 2003).
Sau khi qua giai đoạn chọn lọc, các cụm chồi được tách ra khỏi lá mầm để nuơi cấy trên mơi trường cĩ GA3 nhằm kích thích sự tăng trưởng về chiều cao của chồi. Mơi trường này cũng được bổ sung glufosinate nồng độ 4 mg/l nhằm duy trì áp lực chọn lọc. Việc giảm nồng độ glufosinate trên mơi trường kéo dài chồi cĩ ý nghĩa quan trọng đối với hiệu suất chuyển gen trên đậu nành, vì glufosinate ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng trưởng của chồi. Kết quả này đã được ghi nhận từ một nghiên cứu về glufosinate trong chuyển gen trên đậu nành của Zhang và cộng sựnăm 1999 [57].
Chồi tăng trưởng khơng đáng kể trên mơi trường SE bổ sung 4 mg/l glufosinate ở 2 tuần nuơi cấy đầu tiên. Tuy nhiên, ở nghiệm thức lá mầm 5 ngày tuổi, chồi đặc biệt xanh tốt hơn và xuất hiện một số chồi vươn cao hơn so với số cịn lại trong cụm (hình 3.6 C). Qua lần cấy chuyền thứ 2, chồi đã bắt đầu vươn cao, đạt khoảng từ 1 – 2 cm (hình 3.6 D). Các chồi cĩ chiều cao đủ tiêu chuẩn để chuyển sang mơi trường ra rễ chỉ được thu nhận từ lần cấy chuyền thứ 3, thứ 4 trở đi.