Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là phương pháp tạo dịng in vitro nhằm mục đích thu nhận một sốlượng lớn bản sao của một trình tựxác định.
Phương pháp PCR hình thành dựa trên đặc tính của DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuơn đều cần cĩ sự hiện diện của các mồi chuyên biệt. Mồi là các đoạn DNA ngắn cĩ khảnăng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuơn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn cĩ nhiệt độ khác nhau:
- Giai đoạn biến tính: nâng nhiệt độ lên cao hơn Tm (“nhiệt độ nĩng chảy” của DNA), thường là 95oC, để tách phân tử DNA mẫu ở dạng xoắn kép thành 2 sợi đơn.
- Giai đoạn lai: hạ nhiệt độ thấp (thấp hơn Tm của mồi), khoảng 40oC đến 70oC, cho phép mồi bắt cặp với khuơn.
- Giai đoạn sinh tổng hợp: tăng nhiệt độ lên 72oC, tối ưu cho Taq DNA polymerase tiến hành sinh tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí cĩ đoạn mồi theo chiều 5’ – 3’.
Phản ứng PCR ở thực vật thường tiến hành qua 40 – 45 chu kỳ, sau khoảng 30 chu kỳ thì sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng mẫu ban đầu [3].
Sử dụng PCR đểđánh giá kết quả chuyển gen thực vật
PCR là phương pháp được sử dụng phổ biến để kiểm tra đánh giá kết quả chuyển gen ở mức phân tử. Trước tiên, phải tách chiết DNA với phương pháp thích hợp. Do PCR rất nhạy, nên lượng mẫu dùng để chiết xuất DNA cũng rất nhỏ (5 – 10 mg), lượng DNA chiết xuất tương ứng từ1 ng đến 1 µg.
PCR khuếch đại số lượng lớn đoạn trình tự đặc trưng cho gen chuyển vào tế bào. Vì vậy, luơn cần cĩ hai đoạn mồi 5’ và 3’ đặt trưng cho mỗi DNA hay gen ngoại lai. Các đoạn mồi này cĩ tên chung là mồi đặc trưng (specific primers) thường từ 20 – 30 bp và là các nucleotide tổng hợp.
Nếu trong thực vật xuất hiện gen mới do kỹ thuật chuyển gen, tương ứng với mồi đặc trưng, thì cĩ thể phát hiện gen đĩ trên bản điện di nhờ PCR nhân gen đĩ lên hàng triệu bản sao. Đối với các gen đã biết tồn bộ dãy mã thì ta
chọn ra các dãy nucleotide ngắn (20 – 30 nucleotide) ởhai đầu 5’ – 3’ rồi dùng thiết bị tổng hợp DNA tạo nên mồi đặc trưng [3].