2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2 Phương pháp
2.2.11 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện
2.2.11.1Mục tiêu
- Thu nhận DNA cây chuyển gen giảđịnh.
- Chứng minh sự hiện diện của gen bar trong genome cây chuyển gen.
2.2.11.2Phương pháp
Tách chiết DNA (sử dụng bộ Kit tách chiết DNA thực vật của cơng ty Sigma)
- Chọn 8 cây chuyển gen giảđịnh đã qua thử nghiệm leaf - painting, trong đĩ:
+ 2 cây cĩ 3 lần nhạy với Liberty (S – S – S) + 2 cây cĩ 1 lần kháng, 2 lần nhạy (R – S – S) + 2 cây cĩ 2 lần kháng, 1 lần nhạy (R – R – S) + 2 cây cĩ 3 lần kháng với Liberty (R – R – R)
- Thu nhận mỗi cây 1 đĩa lá non đường kính 0,5 – 0,7 cm cho vào các eppendorf 2 ml sạch và giữ trong đá. Đây là các lá non nhất của cây và khơng trải qua thử nghiệm leaf – painting.
- Thêm 100 µl Extraction Solution, đĩng chặt eppendorf và vortex kỹ. - Ủở 95oC, 10 phút.
- Thêm 100 µl Dilution Solution và vortex nhẹđể trộn đều. - Bảo quản mẫu ở 2 – 8oC.
PCR (sử dụng bộ Kit PCR Extract-N-AmpTM Plant PCR của Sigma)
- Cho các thành phần phản ứng như bảng 2.1vào eppendorf 0,5 ml sạch. - Trộn đều và ly tâm nhẹ.
- Đặt mẫu vào máy PCR và chạy theo chương trình như bảng 2.2. - Chạy điện di trên gel Agarose 1%.
Bảng 2. 2: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen bar
Thành phần Thể tích (µl)
Extract-N-Amp PCR reaction mix 10
DNA 4
Mồi 3’ 0,4 µM
Mồi 5’ 0,4 µM
dd H2O -
Tổng thể tích 20
Bảng 2. 3: Chương trình PCR khuếch đại gen bar
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 94oC 3 ph 1 Biến tính 94oC 0,5 ph Bắt cặp 55oC 0,5 ph 30 Kéo dài 72oC 1 ph Kết thúc 72oC 10 ph 1 Giữ 4oC
2.2.11.3Chỉ tiêu theo dõi
Kích thước sản phẩm PCR trên bảng điện di.