Kể từ khi nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu nành đầu tiên được cơng bố vào năm 1988 (Hinchee và cộng sự, 1988; McCabe và cộng sự, 1988), đậu nành biến đổi gen đã được nghiên cứu phát triển và nhân giống rộng rãi bởi các nhà sản xuất của Mỹ, Argentina, Canada, Brazil…Đậu nành kháng thuốc diệt cỏ “Roundup – ready” là sản phẩm độc quyền của cơng ty Monsanto bắt đầu từ những năm 1990. Ngày nay, họ cung cấp giống cho hơn một nửa diện tích trồng đậu nành tại Mỹ. Brazil là nước sản xuất đậu nành lớn thứ hai sau Mỹ, đang trong quá trình tranh luận để cơng nhận về mặt luật pháp đối với cây trồng biến đổi gen (bao gồm đậu nành), tuy nhiên một số báo cáo cho rằng hơn một nửa lượng đậu nành trồng tại miền bắc Brazil đã là các giống được biến đổi gen [12].
Genome của đậu nành cũng đã được giải trình tự trong thời gian gần đây bởi các nhà nghiên cứu của viện Energy – Joint Genome (DOE - JGI) mở ra nhiều cơ hội mới cho cơng tác nhân giống và chuyển gen đậu nành. Cĩ khoảng
60.000 gen được phân tích trong đĩ 5.671 là các nhân tố phiên mã sẽ quyết định kiểu hình bao gồm kháng hạn, kháng ngập úng, nồng độ protein và dầu cao…[55].
Các tính trạng đã và đang quan tâm được nghiên cứu bao gồm [25], [65].
- Kháng tuyến trùng: Hơn 100 lồi tuyến trùng cĩ thể xâm nhiễm vào cây đậu nành, gây hư hại rễ, làm cây héo và do đĩ làm năng suất giảm. Khi xâm nhiễm vào rễ, tuyến trùng tiết một số các hợp chất làm cho một số tế bào của rễ hình thành nên một cấu trúc đặc biệt gọi là hỗn bào SCN. Gen kháng SCN tựnhiên đã được định vị và dịng hĩa để chuyển vào cây đậu nành. Ngồi ra, người ta cịn tạo ra các cây kháng tuyến trùng bằng cách chuyển vào cây gen mã hĩa cho các peptide ức chế tuyến trùng,ví dụnhư Oc-I∆D86 hay CpT1.
- Kháng nấm: Cĩ hơn 40 lồi nấm gây bệnh đã được xác định là cĩ hại lên sự phát triển của thực vật, trong đĩ cĩ các lồi xâm nhiễm trên cây đậu nành mà nghiêm trọng nhất là Phytophthora (gây thối rễ). Các gen kháng với
Phytophthora tự nhiên (Rps) cũng đã được nhận diện, phân lập và chuyển vào cây đậu nành (Gao và cộng sự, 2005). Ngồi ra Sclerotina sclerotiorum (một loại mốc trắng) cũng là một tác nhân gây quan trọng trên đậu nành. Gen OXO
đã được nghiên cứu biến nạp vào đậu nành để giúp cây kháng với mốc trắng.
- Kháng virus: Cĩ khoảng hơn 100 loại virus gây hại trên thực vật, trong đĩ virus khảm BPMV và SbDV là hai loại virus quan trọng nhất tác động lên đậu nành (Conner và cộng sự, 2004). Phương pháp biến nạp làm im lặng gen sau phiên mã thơng qua RNA đã được sử dụng để tạo ra các cây chuyển gen kháng virus, bằng cách chuyển một cassette gồm mạch sense và mạch antisense của gen mã hĩa cho protein vỏ virus (CP – coat protein) vào cây.
- Kháng cơn trùng: Cĩ rất nhiều lồi cơn trùng tấn cơng vào cây đậu nành (Kogan và Turnipseed, 1987). Bt (phân lập từ Bacillus thuringiensis) được xem là chiến lược hiệu quả nhất cho việc tạo cây đậu nành chuyển gen kháng cơn trùng. Hơn 50 gen độc Bt đã được dịng hĩa cho mục đích này (Zhu và cộng sự, 1999). Bên cạnh gen Bt, protein TcdA (được phân lập từ
Photorhabdus luminescens) cũng được chứng minh là cĩ tiềm năng ứng dụng trong thực vật chuyển gen kháng cơn trùng (Liu và cộng sự, 2003).
- Kháng thuốc diệt cỏ: Ngày nay, kháng thuốc diệt cỏ là tính trạng phổ biến nhất của cây chuyển gen. Hơn 85% đậu nành ở Mỹvà 56% đậu nành trên thế giới là đậu nành kháng thuốc diệt cỏ. Các gen mã hĩa cho tính trạng kháng các thành phần trong thuốc diệt cỏ đã được ứng dụng gồm: ALS (acetolactate synthase), aroA (phân lập từ Agrobacterium dịng CP4), GAT (phân lập từ
Bacillus lichenformis), PAT (phân lập từ Streptomyces viridochromogenes),
BAR (phân lập từStreptomyces hygroscopicus).
- Kháng các stress phi sinh học: Tạo ra cây chuyển gen kháng với các stress phi sinh học là một thách thức lớn với cơng nghệ sinh học thực vật. Các stress này bao gồm: hạn hán, lạnh, tính mặn, nhiệt và kim loại nặng. Một số gen tiềm năng cho kháng stress phi sinh học trên cây đậu nành là: CAX1 (mã hĩa cho protein của kênh vận chuyển cation/proton trên màng tế bào, ứng dụng trong việc tạo cây chuyển gen kháng mặn), P5CR (mã hĩa cho một enzyme chìa khĩa trong con đường tổng hợp proline, tích lũy proline cĩ thể dẫn đến sự hình thành tính kháng hạn và kháng nhiệt độ cao)…
- Thay đổi thành phần dầu: Dầu đậu nành cũng tương tự như các loại
dầu thực vật khác, chứa 5 loại acid béo thường gặp là: palmitic acid (16:0, ~11%), stearic acid (18:0, ~4%), oleic acid (18:1, ~22%), linoleic acid (18:2, ~53%) và linolenic acid (18:3, ~8%) (Parrott và Clemente, 2004). Mục tiêu chiến lược để làm gia tăng chất lượng dầu đậu nành là giảm hàm lượng acid béo bão hịa và acid béo chưa bão hịa đa (polyunsaturated), đồng thời tăng hàm lượng các acid béo bão hịa đơn (monounsaturated). Ngồi lợi ích cho sức khỏe con người, việc tạo đậu nành chuyển gen cĩ hàm lượng oleic acid cao (80%) và hàm lượng acid béo bão hịa cũng như acid béo bão hịa đa thấp (lần lượt là 6% và 5%) bằng cách khĩa sự biểu hiện của gen FAD2đem lại tiềm năng ứng dụng làm dầu sinh học (biodiesel hay biofuel). Các cơng trình nghiên cứu vềthay đổi thành phần dầu cây đậu nành được liệt kê trong bảng 1.1.
- Thay đổi hàm lượng protein: Đậu nành là một trong những thực phẩm giàu protein nhất (40% trọng lượng là protein) bao gồm chủ yếu là 2S, 7S và 11S globulin (cịn được gọi là conglycinin và glycinin). Gen mã hĩa cho conglycinin và glycinin đã được phân lập và dịng hĩa vào một vector biểu hiện antisense vào năm 2002 (Kinney và Fader). Việc biến nạp cấu trúc này sẽ tạo ra các cây đậu nành khơng cĩ protein 7S hoặc 11S.
- Thay đổi thành phần amino acid: Động vật hữu nhũ hấp thu các
amino acid từ thực phẩm, một trong số các amino acid quan trọng là lysine. Để bổ sung lysine vào hạt đậu nành, người ta tạo cây chuyển gen với 2 gen mã hĩa cho enzyme liên quan đến con đường sinh tổng hợp lysine là AK và DHDPS. Sự biểu hiện của DHDPS và AK đã làm tăng lượng lysine lên 100 lần (Falco và cộng sự, 1995). Ngồi ra cịn cĩ các gen mục tiêu khác để làm gia tăng giá trị dinh dưỡng cho hạt đậu nành như gen mã hĩa cho methionine và cysteine.
- Bổ sung vitamin E: Vitamin E là một nhĩm các hợp chất gồm cĩ 8 dạng: α-, β-, γ- và δ-tocopherol và 4 dẫn xuất chưa bão hịa α-, β-, γ- và δ- tocotrienol. Hạt đậu nành tổng hợp tocopherol với tỉ lệ: γ-tocopherol 60 – 65% và δ-tocopherol 20 – 26%, tuy nhiên các tocopherol này cĩ hoạt tính thấp. Việc chuyển gen HGGT làm tăng tích lũy vitamin E tổng lên 10 – 15 lần. Gen At- VTE3 từ Arabidopsis đã được dịng hĩa và chuyển vào đậu nành cho kết quả tăng tích lũy α-tocopherol lên 95%.
Bảng 1. 1: Một số cơng trình nghiên cứu về chuyển gen đậu nành cơng bố trong và ngồi nước [22], [23], [25], [27], [37], [47], [48], [49], [53], [58]
Tính trạng Gen chuyển Nguồn gen Phương pháp Tác giả
Tuyến trùng OcI_D86 O. sativa Agrobacterium Urwin, 1998 Tuyến trùng MSP dsRNA H. glycines Bắn gen Trick, 2004 Tuyến trùng pat-10 dsRNA H. glycines Agrobacterium Ren, 2005
Tuyến trùng 16D10 M. incognita Floral dip Hussey và Huang, 2006
Tính trạng Gen chuyển Nguồn gen Phương pháp Tác giả
Sclerotinia gf-2.8 T. aestivum Agrobacterium Donaldson, 2001 Phytophthora Rps1-k G. max Agrobacterium Gao, 2005 Cơn trùng cry1Ab B. thuringiensis Bắn gen Parrott, 1994
Cơn trùng cry1Ac B. thuringiensis Bắn gen Stewart, 1996 Cơn trùng cry1A B. thuringiensis Agrobacterium Macrae, 2005 Cơn trùng TcdA P. luminescens Agrobacterium Liu, 2003 Thuốc diệt cỏ EPSPS A. CP4 Bắn gen Padgette, 1995 Thuốc diệt cỏ GAT B. lichenformis Agrobacterium Castle, 2004 Thuốc diệt cỏ Os-mALS O. sativa Bắn gen Tougou, 2009
Thuốc diệt cỏ bar S. hygroscopius Agrobacterium Tran Thi Cuc Hoa, 2008
Virus CP SbDV Bắn gen Tougou., 2006 Virus PCP BPMV Bắn gen Reddy, 2001
Stress muối CAX1 G. max Lọc chân
khơng Luo, 2005 Stress
hạn/nhiệt P5CR A. thaliana Agrobacterium Simon-Sarkadi, 2005 Thiếu sắt FRO2 A. thaliana Agrobacterium Vasconcelos, 2006
Dầu FAD2-1
antisense G. max Agrobacterium Buhr, 2002
Dầu FatB + FAD2-
1 antisense G. max Agrobacterium Buhr, 2002
Dầu FAD2-1 G. max Bắn gen Kinney, 1998
Dầu dapA
(DHDPS) E. coli Bắn gen Kinney, 1998 Dầu FADB G. max Bắn gen Cahoon, 2003 Dầu δ-6 desaturase Borage Agrobacterium Sato, 2004 Dầu δ-6 desaturase Borage Agrobacterium Eckert, 2006
Dầu δ-15
desaturase A. thaliana Agrobacterium Eckert, 2006
Tính trạng Gen chuyển Nguồn gen Phương pháp Tác giả
Dầu FAD2-1 RNAi G. max Agrobacterium Geliang Wang, 2008
Protein
7S
Conglycinin G. max Bắn gen Kinney và Fader, 2002 Protein 11S Glycinin G. max Bắn gen Kinney và Fader, 2002 Protein β-casein Bovine Bắn gen Maughan, 1999
Protein P34 G. max Bắn gen Herman, 2003 Amino acid AK (lysC) E. coli Bắn gen Falco, 1995 Amino acid DHDPS Corynebacterium Bắn gen Falco, 1995 Amino acid 2S albumin Brazil nut Townsend, 1994 Amino acid 15 kDa zein Z. mays Bắn gen Dinkins, 2001
Amino acid
Modified β-
conglycinin Synthetic Agrobacterium Rapp., 2005
Amino acid 27 kDa zien Z. mays Bắn gen Li, 2005 Vitamin E HGGT H. vulgare Agrobacterium Cahoon, 2003 Vitamin E
At-VTE3/At-
VTE4 A. thaliana Agrobacterium Van Eenennaa, 2003
Phytate Phytase Aspergillus niger Bắn gen Denbow, 1998 Phytate Phytase G. max Bắn gen Chiera, 2004
Phytate
GmMIPS1
hairpin G. max Nunes, 2006
Protein cơng nghiệp
Dragline silk Synthetic Bắn gen Barr, 2004
Acid béo MomoFadX/I mpFadX M. charantia/I. balsamia Bắn gen Cahoon, 1999 Acid béo CoFADX2-
1/CoFADX2-2 C. officinalis Bắn gen Cahoon, 2001 Acid béo CoA/FAE1 L. douglasii Bắn gen Cahoon, 2006
Acid béo CYP726A1
Asteraceae/
Euphorbaceae Bắn gen Cahoon, 2002 Acid béo LuFADBA L. usitatissimum Agrobacterium Vrinten, 2005
Tính trạng Gen chuyển Nguồn gen Phương pháp Tác giả
Acid béo DsFAD2-
1/DsFAD2-2
D. sinuate Bắn gen Cahoon và Kinney, 2004
Marker-free Cre/loxP P1 bacterio phage Agrobacterium Zhongsen Li, 2007 Marker-free Sm GFP Aequerea vitoria Bắn gen Jianfeng Liu, 2009 Marker-free dapA E. coli Bắn gen Rao, 2009
Thời gian ra hoa
rolA, rolB, rolC
1.6 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong phân tích cây chuyển gen 1.6.1 Phương pháp thử in vitro và ex vitro khả năng biểu hiện gen chọn