(A)Actinoplanes brasiliensi (VTCC - A - 2908). (B) XKBL2 (Coste)
2.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh. Trong số 5500 chất kháng sinh hiện nay có 4000 chất có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng rộng, kìm hãm và ức chế được nhiều loại vi sinh vật khác nhau [19].
Rất nhiều chất kháng sinh được sinh ra bởi xạ khuẩn đang được sử dụng rộng rãi trong thực tế hiện nay như:
-Streptomycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces griseus có khả năng kháng các vi khuẩn Gram dương khá mạnh, được sử dụng để diều trị các bệnh dịch hạch, ho gà và quan trọng hơn cả là bệnh lao [26].
-Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được phát hiện từ chủng xạ khuẩn Streptomyces fradiae, có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương và Gram âm, đặc biệt chống được nhiều loại vi khuẩn kháng penicillin và streptomycin [13].
-Gentamycin: Có nguồn gốc từ Micromonospora purpurea, có phổ kháng sinh rộng, có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram dương như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại penicillin và Gram âm như màng não cầu, lậu cầu. Trong y học hiện nay, Gentamycin chủ yếu dùng để diều trị các bệnh nhiễm Pseudomonas [10].
-Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Loại kháng sinh này có phổ rộng, chống lại được cả vi khuẩn Gram dương lẫn Gram âm. Ngoài được sử dụng trong y học, Tetracyclin còn được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm [1].
-Cloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezueae, có phổ kháng sinh rộng với vi khuẩn Gram dương và Gram âm [28].
-Erythromycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces erythreus, có phổ kháng sinh rộng đối với các vi khuẩn Gram dương, được sử dụng để điều trị viêm phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [31].
-Novobiocin: Có nguồn gốc từ Streptomyces spheroides và Streptomyces niverus, có hoạt tính mạnh với các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt có khả năng chống các tụ cầu đã kháng penicillin và một số chất kháng sinh khác [18].
-Amphoterycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces nodosus, được dùng để điều trị các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [4].
-Actinomycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces antibiticus có hoạt tính kìm hãm sự phát triển của các khối u ác tính, được dùng để điều trị một số bệnh ung thư [32].
-Daunorubixin: Có nguồn gốc từ Streptomyces coeruleorubidus, được dùng để điều trị các bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [27].
Tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, TS. Phan Thị Phương Hoa và cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống
chuẩn Vi sinh vật (VTCC) và tìm được 167 chủng được lựa chọn với khả năng kháng cao nhất cả hai chủng kiểm định Micrococcus luteus NBRC 13867 và
Escherichia coli NBRC 14237 [9]. Các chủng xạ khuẩn này được tiếp tục sàng lọc khả năng kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 và R10 do PGS. TS. Phan Hữu Tôn (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) và cộng sự phân lập. Trong số 167 chủng xạ khuẩn này, 17 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo. Để nghiên cứu khả năng kháng đặc hiệu đối với Xoo của các 17 chủng xạ khuẩn, các chủng vi sinh vật Bacillus subtilis NBRC 3134, Saccharomyces cerevisiae NBRC 10217, Azotobacter sp. VTCC - B - 106 và Pseudomonas putida VTCC - B - 657 được sử dụng. 5 chủng VN06 - A -353, VN08 - A - 306, VN08 - A - 352, VTCC - A - 99, VN10 - A - 44 và VN08 - A12 có tính đặc hiệu cao với Xoo, chúng chỉ ức chế một loại vi sinh vật kiểm định. Trong số đó, chủng VN08 - A12 sinh trưởng tốt nhất và không gây ức chế những vi sinh vật có lợi như Azotobacter sp. (VTCC - B - 106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657). Những thử nghiệm ngoài đồng ruộng trên 2 giống lúa Oryza sativa L. SS1 và Oryza sativa L. KD18 cho thấy dịch nuôi cấy của chủng VN08 - A12 làm giảm đáng kể tổn thương do
Xoo gây ra trên lá lúa [9].
2.2. Vi khuẩn Bacillus
2.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn Gram dương, thuộc chi Bacillaceae, có dạng hình que, thường được tìm thấy trong đất. Đây là một vi khuẩn hiếu khí, có khả năng sinh bào tử. Bacillus có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống khó khăn, chúng có khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" trong thời gian dài dưới các điều kiện khắc nghiệt. Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số là vô hại.
Qua Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol. Hầu hết chúng là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 – 450C, nhưng cũng có loài ưa nhiệt tối ưu lên tới 650C [24].
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH=7, một số phù hợp với pH=9-10 (Bacillus alcalophillus), có loại phù hợp với pH=2-6 (Bacillus acidocaldrius). Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,...) nên chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường,...
Một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được nhà khoa học Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [50]. Chúng là vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ (3-5).0,6µm, sinh trưởng tốt nhất ở 36-500C, tối đa là 600C. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào, khuẩn lạc khô, không màu hoặc xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo lớp màng mịn trên về mặt thạch, bám chặt vào môi trường. Là ưa nhiệt cao, bào tử cũng chịu nhiệt tốt. Bào tử của Bacillus subtilis: hình bầu dục 0,6-0,9µm. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống tới vài chục năm thậm chí 200-300 năm [45]. Chúng phân hủy pectin và polysacharit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Phần lớn thông tin chúng ta có được về đặc điểm sinh hóa, di truyền của vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [50].
Bacillus thurringiensis
Bacillus thurringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi
Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto. Bacillus thurringiensis là vi khuẩn sinh bào tử, hô hấp hiếu khí không bắt buộc, có khả năng chuyển động. Chúng có khả năng sinh nội bào tử giúp tăng khả năng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt.
Bacillus thurringiensis (Bt) là một trực khuẩn gram dương, hiếu khí không bắt buộc, có kích thước 3-6µm có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng lẻ và xếp thành từng chuỗi. Nhu cầu dinh dưỡng của chúng không cao, chất dinh dưỡng chủ yếu là protein động vật. Sinh trưởng tốt trong điều kiện 12-140C, nhiệt độ tối ưu là 27-350C, thích hợp với pH kiềm từ 6-8.
Bacillus thurringiensis là chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất chế phẩm phòng, trị bệnh sử dụng trong nông nghiệp.
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự Bacillus subtilis nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm, thành phần G + C của Bacillus subtilis khoảng 41,5% - 43,5% còn trong chủng Bacillus amyloliquefaciens là 43,5 – 44,9%.
Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước. Do có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease, lipase , phytase, xenlulase và xylanase nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công nghiệp thuộc da. Ngoài ra, Bacillus amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các lĩnh vực khác như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như vitamin,
nucleoside purine (inosine, guanosine), chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA.
Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ Bacillus amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lượng môi trường nước, tăng cường các phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV gây bệnh cho tôm, cá,…[37].
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis là vi khuẩn hoại sinh, bào tử hình ovan, phát tán chủ yếu trong đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc. Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt buộc.
2.2.2. Khả năng sinh hoạt chất của vi khuẩn
Nhờ vào khả năng sinh hoạt chất các chủng Bacillus được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực sản xuất khác nhau để phục vụ đời sống con người. Bacillus là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh hại cây trồng. Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác động rộng, không gây hại cho con người và cây trồng. Mặt khác, Bacillus còn tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân hủy thành những chất hữu cơ đơn giản cho cây trồng dễ sử dụng, giúp cải tạo đất, khống chế và tiêu diệt một số loại vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng bởi các chức năng sinh học chuyên biệt của chúng:
-Bacillus subtilis có dạng hình que, ngắn, phân hủy pectin và polysacarit ở mô thực vật, nhỏ có khả năng sinh enzyme đặc biệt là α amylase và protease kiềm có giá trị cao.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Bacillus subtilis nói riêng và các dòng Bacillus sp có khả năng tiết ra kháng sinh tiêu diệt hoặc gây ức chế tác động tới các loại vi sinh vật gây bệnh, gây hại khác nhằm cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và không gian sống trong môi trường. Các loại kháng sinh do Bacillus sp tiết ra được ghi nhận và có mục đích kháng vi sinh vật gây hại có tới hơn 20 loại khác nhau như: subtilin, bacillibactin, iturin, subtilosin, bacilysin, mysobaccillin, ericin, mersacidin… Hầu hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt vật chủ hay tiết ra môi trường gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Các chất kháng sinh này có tác dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau. Tăng cường hệ miễn dịch cho môi trường đặc biệt là môi trường nước nuôi trồng thủy sản.
Khi bổ sung một lượng lớn Bacillus vào môi trường nước thải, nước ao nuôi hoặc cơ chất chúng sẽ bắt đầu thích nghi với môi trường, sử dụng các chất hữu cơ và vô cơ có trong nước thải để phát triển tạo thành quần thể vi sinh vật hữu ích từ đó hình thành bùn hoạt tính. Bacillus có khả năng tiết ra enzyme protease nên góp phần phân hủy nhanh các chất hữu cơ, enzyme lecitinase thủy phân các chất béo phức hợp và enzyme cenllulase biến đổi cellulose thành đường, cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và oxy hòa tan với các vi sinh vật gây thối. Do đó Bacillus thường được dùng để phân hủy chât hữu cơ, ủ phân và khử mùi thôi từ quá trình phân huỷ.2
-Bacillus thuringiensis có khả năng tổng hợp protein gây tệ liệt ấu trùng của một số loài côn trùng gây hại, trong đó có sâu đục quả bông, các loài sâu đục thân ngô, đều là sâu hại thực vật phổ biến, có khả năng gây ra những sự tàn phá nghiêm trọng. Chúng tiết ra các ngoại độc tố α,ngoại độc tố β, ngoại độc tố γ (là các enzyme) và hình thành tinh thể độc gây phân huỷ mô trong cơ thể côn trùng bị tác động, hoặc kìm hãm nucleotide/DNA polymerase phá hủy mô tế bào.
Nhờ nghiên cứu các đặc tính này thuốc trừ sâu sinh học Bt được sản xuất. Ở Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis var.) đã được nghiên cứu từ năm 1971. Hơn 20 chế phẩm Bt nhập khẩu và nội địa đã cho kết quả tốt trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng đối với một số sâu hại chính trên đồng ruộng như sâu xanh bướm trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo. Các lọai sản phẩm thương mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc ...
-Bacillus cũng được sử dụng một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc-gia cầm,…Có thể kể đến những nghiên cứu sau đây:
Năm 2001 này, Phan Ngọc Kính sử dụng chế phẩm EM trong chăn nuôi heo thịt cho thấy chênh lệch tăng trọng so với đối chứng tăng từ 20-34%, tỉ lệ thịt xẻ tăng 1,3%, tỉ lệ nạc tăng 4,5%.
Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo mẹ với liều 0,8; 1,0 và 1,2 tỷ CFU/kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa.
Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử dụng probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E.coli trên heo con sau cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E.coli thải qua phân, giảm tỉ lệ tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn.
Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi. Kết quả đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng ST vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi.
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.Vật liệu và hóa chất 1.1. Vật liệu 1.1. Vật liệu
- Các mẫu đất thu thập tại vùng trồng lúa của huyện Đông Anh - Hà Nội; Kim Bảng - Hà Nam (6 mẫu).
- Các vi khuẩn kiểm định: Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá (của trung tâm Coste).
1.2. Hóa chất và dụng cụ
Hóa chất:
- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4. 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2SO4, NaHPO4.12H2O, Ca(NO3)2.4H2O...
- Cao thịt, cao nấm men, peptone...
- Các loại hóa chất khác như thạch, tinh bột tan, casein, đường saccarose... Dụng cụ:
- Bình tam giác và ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml - Nồi khử trùng ướt (ALP) (Đài Loan)
- Tủ sấy khô (Sellab – Mỹ) - Tủ ấm ổn nhiệt (Sellab – Mỹ) - Máy đo pH (Nhật Bản)
- Máy lắc ổn nhiệt (Sellab – Mỹ) - Tủ cấy vô trùng (Singapo) - Cân phân tích (Nhật Bản)
- Máy li tâm lạnh (Mikro – Đức) - Kính hiển vi quang học (Hàn Quốc)
Các dụng cụ vi sinh: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, que trang, đèn cồn, giấy lọc, giá đỡ ống nghiệm, phễu lọc ...
1.3. Môi trường nghiên cứu
-Môi trường Wakimoto (Wakimoto Medium, 1995) (1 lít):
Khoai tây gọt vỏ 300 g NaHPO4.12H2O 2 g Ca(NO3)2.4H2O 0,5 g Peptone 5 g Đường Saccharose 15 g Agar 20 g
- Môi trường MPA (1 lít)
Cao thịt 3g
Peptone 5 g
NaCl 5g
Agar 20 g
-Môi trường Gauze (1 lít):
Tinh bột tan 20 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
NaCl 0,5 g
FeSO4 0,01 g
Agar 20 g
- Môi trường ISP1, 1 lít
Tryptone 5 g
Cao nấm men 3 g
Agar 20 g
- Môi trường ISP4, 1 lít
Tinh bột 10 g K2HPO4 1 g MgSO4.7H2O 1 g NaCl 1 g (NH4)2SO4 2 g CaCO3 2 g
Dung dịch muối vi lượng 1 ml
Agar 20 g
2.Phương pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp phân lập Bacillus
Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp (10-3; 10-4; 10-5…). Xử lý sốc nhiệt các ống mẫu đã pha loãng bằng cách: nhúng các ống mẫu đã pha loãng vào bình ổn nhiệt ở 80oC trong 10 phút, lấy ra và đặt ngay vào khay nước đá trong vòng 5 phút.