1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas
1.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
1.2.1. Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Để quan sát đặc điểm hình thái của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn, tiến hành nuôi hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn trên môi trường ISP1 và ISP4 có cắm lam men nghiêng trên mặt môi trường. Sau khi xạ khuẩn phát triển tốt, lam men được lấy ra quan sát dưới kính hiển vi quang học để xác định hình dạng cuống sinh bào tử theo các đặc điểm: S - thẳng, RF - lượn sóng, RA – hình móc câu hay xoắn và xoắn hoàn
toàn. Các mẫu thí nghiệm được nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt ở 300C và quan sát hình thái khuẩn ty tại các thời điểm 7, 14, và 21 ngày. Kết quả quan sát tại 3 thời điểm cho thấy chủng XKBL2 có cuống sinh bào tử dạng S (thẳng), chủng XKBL3 có cuống sinh bào tử dạng RA có hình hình móc câu sau 7 ngày và dạng xoắn sau 14 ngày nuôi cấy (hình 4.3).
Hình 4. 3. Sợi khuẩn ty khí sinh của chủng XKBL2 (A,C,E) và chủng XKBL3 (B,D,F) tại thời điểm 7 – 14 – 21 ngày
Bảng 4. 4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XKBL2 và chủng XKBL3 trên môi trường Gauze và ISP
Môi trườn g
Sau 7 ngày Sau 14 ngày Sau 21 ngày
Màu KTKS MàuKTCC Màu KTKS Màu KTCC Màu KTKS Màu KTCC
XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 Gaus e 1 Trắng Nâu Vàng Nâu, xám Trắng Nâu Trắng, Phớt hồng Nâu, xám Phớt hồng Nâu Phớt hồng Nâu ISP1 Trắng Nâu Vàng, trắng Nâu Trắng Nâu Vàng, Phớt hồng Nâu Phớt hồng Nâu, xám Vàng, Phớt hồng Nâu ISP4 Trắng Nâu Vàng Xám, trắng Phớt hồng Trắng, vàng Xám Phớt hồng Nâu, xám Vàng, Phớt hồng Xám
Ghi chú: KTKS: Khuẩn ty khí sinh ,KTCC: Khuẩn ty cơ chất
Quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tan: các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường GauzeI, ISP1 và ISP4 ở nhiệt độ thích hợp tại các thời điểm 7, 14, 21 ngày. Lấy ra quan sát KTCC, KTKS và sắc tố tan tiết ra môi trường theo phương pháp Shirling và Goblied trên bảng màu của Tresner và Backus và quan sát khả năng hình thành melanin của xạ khuẩn. Kết quả quan sát được là chủng XKBL2 sau 7 ngày nuôi cấy thì KTKS có màu trắng trên cả 3 môi trường. Sau 21 ngày nuôi cấy, màu sắc KTKS đều có màu phớt hồng trên tất cả các môi trường. KTCC sau 21 ngày có màu phớt hồng hoặc vàng trên các môi trường. Chủng XKBL3 khi nuôi cấy được 7 ngày KTKS có màu nâu trên các môi trường Gauze I, ISP1, ISP4; Sau 21 ngày nuôi cấy, KTKS có màu nâu xám trên ISP1 và ISP4, trên các môi trường khác KTKS không thay đổi. Trên môi trường Gauze I và
ISP1 KTCC có màu nâu. Khi nuôi cấy trên các môi trường Gauze và môi trường ISP, cả 2 chủng xạ khuẩn XKBL2 và XKBL3 đều không làm thay đổi màu sắc môi trường, chứng tỏ chúng không có khả năng sinh sắc tố tan và không hình thành sắc tố melanin. Từ các hình thái ban đầu quan sát được cho thấy các chủng xạ khuẩn này đều thuộc nhóm Streptomyces.
1.2.2. Đặc điểm hình thái các chủng Bacillus tuyển chọn
Để quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn, tiến hành nuôi chấm điểm các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường MPA,tiến hành quan sát ở các thời điểm sau 24h và 72h (hình 4.8). Mỗi khuẩn lạc đều phát triển từ một vi khuẩn. Có 3 dạng khuẩn lạc chính: dạng S khuẩn lạc thường nhỏ, màu trong, mặt lồi, bờ đều, bóng; dạng M khuẩn lạc đục, tròn lồi hơn dạng S, quánh hoặc dính; dạng R khuẩn lạc thường dẹt, bờ đều hoặc nhăn nheo, mặt xù xì, khô.
Bảng 4. 5.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chủng vi khuẩn
Đường viền Hình dáng KL Kích thước KL
(mm) Bề mặt
24h 72h 24h 72h 24h 72h 24h 72h
KXT1 Răng
cưa
Hình
hoa Tròn Tròn 8 19 Nhăn Nhăn
PG13.1 Trơn Hình tròn Tròn Tròn 6 7 Trơn bóng Trơn bóng PD17 Răng cưa Hình hoa Mọc lan Mọc
lan 7 9 Nhăn Nhăn
KND Hình cánh hoa Hình cánh hoa Tròn Mọc lan 7 16 Trơn bóng Nhăn
1.3. Đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Với mục đích tuyển chọn các chủng VSV để sản xuất chế phẩm, các chủng tuyển chọn được đánh giá khả năng đồng sinh trưởng bằng phương pháp đường vuông góc. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường thạch gauze với các chủng xạ khuẩn XKBL2, XKBL3 và trên môi trường MPA với các chủng vi khuẩn KND, PD17, PG13.1, KXT1 trong điều kiện 300C, trong 24h (120h), sau đó đem quan sát:
Hình 4. 5. Khả năng đồng sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Hình 4. 6. Khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn Trước khi sản xuất chế phẩm sinh học cần đánh giá đồng thời khả năng đồng sinh trưởng của cả vi khuẩn và xạ khuẩn tuyển chọn trên môi trường dịch thể.
Tiến hành nuôi các chủng vi sinh vật tuyển chọn trên môi trường Gauze lỏng bổ sung cao thịt 5g/l. Sau 3 ngày kiểm tra kết quả. Dịch nuôi vi sinh được phân lập
trên 2 loại môi trường dinh dưỡng chuyên biệt dành cho vi khuẩn, xạ khuẩn là ISP4 và MPA.
Bảng 4. 6. Sinh khối các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong nuôi cấy đồng sinh trưởng
Chủng vi sinh Mật độ tế bào CFU/ml
Vi khuẩn 2,3.108
Xạ khuẩn 3,1.107
Hình 4. 7. Khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn Kết quả kiểm tra cho thấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn sinh trưởng tốt không có tính đối kháng lẫn nhau. Do đó có thể sản xuất chế phẩm có chứa đồng thời cả 2 chủng xạ khuẩn và 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn
2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
2.1.1. Ảnh hưởng của pH
Độ pH của môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Các ion H+, OH- là hai loại ion có tác động lớn nhất đến hoạt động của vi sinh vật, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng của VSV. Vì vậy, việc xác định pH ban đầu và duy trì pH cần thiết trong suốt thời gian sinh trưởng của vi sinh vật là rất quan trọng.
Đối với xạ khuẩn: môi trường Gauze lỏng được điều chỉnh về các mức pH khác nhau: 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 7; 8; 8,5; 9. Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt ở 300C, 150 vòng/phút trong 120h, thu mẫu, tiến hành lọc bằng giấy lọc và cân sinh khối khô của xạ khuẩn sau khi sấy đến trọng lượng không đổi.
Đối với vi khuẩn Bacillus, nuôi các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường MPB trong tủ ổn nhiệt ở 300C, 150 vòng/phút trong 24h, đo mật độ quang dịch canh trường ở bước sóng 560nm.
Hình 4. 8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Bảng 4. 7. Ảnh hưởng của pH đến các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Độ pH
Mật độ đo quang ở bước sóng 560nm Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
KND PD17 PD13.1 KXT1 KND PD17 PD13.1 KXT1 4,0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,5 0 0 0 0 0 0 0 0 5,0 0,87 0,80 0,59 0,63 8 10 11 8 5,5 0,98 0,99 0,85 0,89 12 14 15 16 6,0 1,12 1,10 1,06 1,14 19 17 20 20 7,0 1,54 1,37 1,29 1,42 20 19 23 21 8,0 1,02 1,27 1,38 1,25 20 18 20 22 8,5 0,68 0,79 0,75 0,79 12 7 11 9 9,0 0 0 0 0 0 0 0 0
Từ kết quả thu được ta thấy pH có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của các chủng VSV tuyển chọn. Hai chủng xạ khuẩn phát triển ở khoảng pH rộng từ 5,5 - 9, sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 7 – 8,5. Ở pH = 4, pH = 4,5 và pH = 5 hai chủng xạ khuẩn không phát triển. Bốn chủng vi khuẩn phát triển ở khoảng pH từ 5 – 8,5, sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 6 – 8. Ở pH trên 8 vừa dưới 5 hầu hết các chủng vi khuẩn đều sinh trưởng kém.
Như vậy cả 2 chủng xạ khuẩn và 4 chủng vi khuẩn được chọn đều có khoảng pH phát triển mạnh tương đối giống nhau từ 6 – 8,5 từ trung tính tới kiềm nhẹ, thích hợp để ứng dụng vào sản xuất.
2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một yếu tố tác động trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và phát triển của VSV, mỗi chủng VSV có một khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau, ở đó chúng có khả năng phát triển và sinh trưởng tốt nhất. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng sinh bào tử mà các xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ khá rộng. Nhằm tìm được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng vi khuẩn Xoo của xạ khuẩn XKBL2 và XKBL3, chủng giống được nuôi cấy trong môi trường Gauze lỏng, ở các mức nhiệt độ: 150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C, 550C trong 120h, tốc độ 150 vòng/phút. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8 và hình 4.10:
Bảng 4. 8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và kháng
Xanthomonas oryzae pv. oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ (độ C)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml) Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
XKBL2 XKBL3 XKBL2 XKBL3 15 0,082 0,961 0 4 20 0,198 0,181 7 12 25 0,180 0,193 11 12 30 0,214 0,213 15 16 35 0,212 0,209 14 15 40 0,167 0,191 14 12 45 0,148 0,163 12 10 50 0,120 1,120 9 6 55 0,087 0,081 0 0
Hình 4. 10. Sự sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn ở 200C, 300C, và 450C Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.8 và hình 4.10 cho thấy các chủng xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ dài từ 150C đến 550C, sinh trưởng và sinh hoạt tính mạnh nhất trong khoảng 250C đến 450C. Ở các nhiệt độ thấp hơn 200C các chủng xạ khuẩn sinh trưởng chậm đồng thời vòng kháng khuẩn của dịch lên men đo được cũng thấp, từ trên 200C các chủng xạ khuẩn bắt đầu sinh chất kháng khuẩn và đạt được cao nhất trong khoảng 25 – 350C.
Tương tự, để tìm được nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng
Xoo các chủng vi khuẩn chọn lọc được nuôi cấy trong môi trường MPB ở các mức nhiệt độ: 150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C, 550C trong 24h, tốc độ
150 vòng/phút, đo mật độ quang ở bước sóng 560 nm để đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.9:
Bảng 4. 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và sinh chất kháng của các vi khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ (độ C)
Giá trị đo quang ở bước sóng 560 nm Đường kính vòng kháng Xoo (mm) KND PD17 PD13.1 KXT1 KND PD17 PD13.1 KXT1 15 0.059 0.147 0.241 0.212 8 9 11 7 20 0.967 1.267 1.361 1.284 20 22 25 21 25 1.176 1.436 1.530 1.449 25 29 30 30 30 1.506 1.656 1.641 1.577 29 31 35 31 35 1.278 1.567 1.632 1.576 30 28 33 27 40 1.187 1.379 1.251 1.186 25 20 24 19 45 0.481 1.268 1.150 0.358 11 15 16 9 50 0.281 0.827 0.861 0.077 8 10 10 5 55 0.167 0.617 0.650 0.015 0 9 11 7
Hình 4. 11. Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở 200C và 300C khi đánh giá bằng phương pháp cấy đường zizac trên môi trường MPA sau 24h
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.9 và hình 4.11 cho thấy các chủng vi khuẩn có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ dài từ 200C đến 500C, sinh trưởng và sinh hoạt tính mạnh nhất trong khoảng 250C đến 350C.
Vi khuẩn Xoo phát triển thích hợp ở 20-300C. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tuyển chọn phát triển mạnh cũng là nhiệt độ mà Xoo
phát triển mạnh nhất. Đây là một điều kiện thuận lợi khi sử dụng các chủng VSV này làm chế phẩm phòng trừ bệnh bạc lá.
2.1.3. Khả năng chịu mặn
Với mục đích ứng dụng các chủng VSV để làm chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh bạc lá lúa. Do vậy cần kiểm tra khả năng chịu mặn của hai chủng xạ khuẩn và bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn. Do hai chủng xạ khuẩn không có tính đối kháng nên được đánh giá chung trong cùng một môi trường.
Chuẩn bị môi trường Gauze lỏng có nồng độ muối dao động từ 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 5%. Cấy xạ khuẩn vào các bình tam giác, sau đó đem nuôi ở nhiệt
độ 300C trong 120h. Sau thời gian nuôi, li tâm dịch môi trường 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Nhỏ 0,2 ml dịch li tâm vào các lỗ thạch đã đục sẵn. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.10 và hình 4.12:
Bảng 4. 10.Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
STT Nồng độ muối (%)
Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml) 1 0 09 0,035 2 0,5 18 0,197 3 1 19 0,220 4 1,5 19 0,223 5 2 19 0,214 6 3 13 0,104 7 5 5 0,050
Hình 4. 12. Đồ thị biểu thị khả năng chịu muối của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối lên tới 5% và sinh trưởng tốt nhất ở nồng độ muối từ 0,5-2%.
Tương tự, chuẩn bị môi trường MPB có nồng độ muối dao động từ 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 5%. Bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn không có tính đối kháng lẫn nhau nên được đánh giá chung trong cùng một môi trường. Cấy vi khuẩn vào các bình tam giác, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 300C để trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 1 ngày. Sau thời gian nuôi, li tâm dịch môi trường 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Nhỏ 0,2 ml dịch li tâm vào các lỗ thạch đã đục sẵn. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.11:
Bảng 4. 11. Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
STT Nồng độ muối (%) Đường kính vòng kháng Xoo (mm) Mật độ đo quang (ở bước sóng 560nm) 1 0 8 0,372 2 0,5 20 1,047 3 1 19 1,116 4 1,5 18 0,989 5 2 19 0,909 6 3 12 0,759 7 5 6 0,642
Từ kết quả trên, các chủng vi khuẩn tuyển chọn cũng có khả năng chịu muối cao, sinh trưởng và sinh hoạt tính mạnh nhất ở nồng độ muối 0,5 -2%
Như vậy, với khả năng sinh trưởng mạnh ở nồng độ muối lên đến 3%, các chủng VSV tuyển chọn có thể thích ứng tốt với những cánh đồng nhiễm mặn ở nước ta.
2.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng và sinh chất đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi sinh vật kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
2.2.1. Nguồn Cacbon
Cacbon có vai trò thiết yếu đối với vi sinh vật và là thành phần cơ bản trong các hợp chất hữu cơ, là cơ chất cung cấp năng lượng cũng như vật liệu để cấu tạo
nên các tế bào vi sinh vật. Do vậy, nó có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của các chủng VSV tuyển chọn.
2.2.1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Đối với xạ khuẩn, thí nghiệm được đánh giá trên môi trường Gauze đã loại bỏ cacbon (tinh bột) được bổ sung thêm một số nguồn cacbon: cám gạo, tinh bột, bột ngô, glucose, đường sacharose, rỉ đường với nồng độ 10 g/l. Cấy 2 chủng xạ khuẩn vào các bình tam giác chứa 100ml môi trường, sau đó đem nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt với thời gian 120h, 150 vòng/phút ở 300C. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 4.13 và bảng 4.12: