Bảng 4. 7. Ảnh hưởng của pH đến các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Độ pH
Mật độ đo quang ở bước sóng 560nm Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
KND PD17 PD13.1 KXT1 KND PD17 PD13.1 KXT1 4,0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,5 0 0 0 0 0 0 0 0 5,0 0,87 0,80 0,59 0,63 8 10 11 8 5,5 0,98 0,99 0,85 0,89 12 14 15 16 6,0 1,12 1,10 1,06 1,14 19 17 20 20 7,0 1,54 1,37 1,29 1,42 20 19 23 21 8,0 1,02 1,27 1,38 1,25 20 18 20 22 8,5 0,68 0,79 0,75 0,79 12 7 11 9 9,0 0 0 0 0 0 0 0 0
Từ kết quả thu được ta thấy pH có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của các chủng VSV tuyển chọn. Hai chủng xạ khuẩn phát triển ở khoảng pH rộng từ 5,5 - 9, sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 7 – 8,5. Ở pH = 4, pH = 4,5 và pH = 5 hai chủng xạ khuẩn không phát triển. Bốn chủng vi khuẩn phát triển ở khoảng pH từ 5 – 8,5, sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 6 – 8. Ở pH trên 8 vừa dưới 5 hầu hết các chủng vi khuẩn đều sinh trưởng kém.
Như vậy cả 2 chủng xạ khuẩn và 4 chủng vi khuẩn được chọn đều có khoảng pH phát triển mạnh tương đối giống nhau từ 6 – 8,5 từ trung tính tới kiềm nhẹ, thích hợp để ứng dụng vào sản xuất.
2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một yếu tố tác động trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và phát triển của VSV, mỗi chủng VSV có một khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau, ở đó chúng có khả năng phát triển và sinh trưởng tốt nhất. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng sinh bào tử mà các xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ khá rộng. Nhằm tìm được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng vi khuẩn Xoo của xạ khuẩn XKBL2 và XKBL3, chủng giống được nuôi cấy trong môi trường Gauze lỏng, ở các mức nhiệt độ: 150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C, 550C trong 120h, tốc độ 150 vòng/phút. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8 và hình 4.10:
Bảng 4. 8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và kháng
Xanthomonas oryzae pv. oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ (độ C)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml) Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
XKBL2 XKBL3 XKBL2 XKBL3 15 0,082 0,961 0 4 20 0,198 0,181 7 12 25 0,180 0,193 11 12 30 0,214 0,213 15 16 35 0,212 0,209 14 15 40 0,167 0,191 14 12 45 0,148 0,163 12 10 50 0,120 1,120 9 6 55 0,087 0,081 0 0
Hình 4. 10. Sự sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn ở 200C, 300C, và 450C Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.8 và hình 4.10 cho thấy các chủng xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ dài từ 150C đến 550C, sinh trưởng và sinh hoạt tính mạnh nhất trong khoảng 250C đến 450C. Ở các nhiệt độ thấp hơn 200C các chủng xạ khuẩn sinh trưởng chậm đồng thời vòng kháng khuẩn của dịch lên men đo được cũng thấp, từ trên 200C các chủng xạ khuẩn bắt đầu sinh chất kháng khuẩn và đạt được cao nhất trong khoảng 25 – 350C.
Tương tự, để tìm được nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng
Xoo các chủng vi khuẩn chọn lọc được nuôi cấy trong môi trường MPB ở các mức nhiệt độ: 150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C, 550C trong 24h, tốc độ
150 vòng/phút, đo mật độ quang ở bước sóng 560 nm để đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.9:
Bảng 4. 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và sinh chất kháng của các vi khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ (độ C)
Giá trị đo quang ở bước sóng 560 nm Đường kính vòng kháng Xoo (mm) KND PD17 PD13.1 KXT1 KND PD17 PD13.1 KXT1 15 0.059 0.147 0.241 0.212 8 9 11 7 20 0.967 1.267 1.361 1.284 20 22 25 21 25 1.176 1.436 1.530 1.449 25 29 30 30 30 1.506 1.656 1.641 1.577 29 31 35 31 35 1.278 1.567 1.632 1.576 30 28 33 27 40 1.187 1.379 1.251 1.186 25 20 24 19 45 0.481 1.268 1.150 0.358 11 15 16 9 50 0.281 0.827 0.861 0.077 8 10 10 5 55 0.167 0.617 0.650 0.015 0 9 11 7
Hình 4. 11. Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở 200C và 300C khi đánh giá bằng phương pháp cấy đường zizac trên môi trường MPA sau 24h
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.9 và hình 4.11 cho thấy các chủng vi khuẩn có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ dài từ 200C đến 500C, sinh trưởng và sinh hoạt tính mạnh nhất trong khoảng 250C đến 350C.
Vi khuẩn Xoo phát triển thích hợp ở 20-300C. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tuyển chọn phát triển mạnh cũng là nhiệt độ mà Xoo
phát triển mạnh nhất. Đây là một điều kiện thuận lợi khi sử dụng các chủng VSV này làm chế phẩm phòng trừ bệnh bạc lá.
2.1.3. Khả năng chịu mặn
Với mục đích ứng dụng các chủng VSV để làm chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh bạc lá lúa. Do vậy cần kiểm tra khả năng chịu mặn của hai chủng xạ khuẩn và bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn. Do hai chủng xạ khuẩn không có tính đối kháng nên được đánh giá chung trong cùng một môi trường.
Chuẩn bị môi trường Gauze lỏng có nồng độ muối dao động từ 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 5%. Cấy xạ khuẩn vào các bình tam giác, sau đó đem nuôi ở nhiệt
độ 300C trong 120h. Sau thời gian nuôi, li tâm dịch môi trường 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Nhỏ 0,2 ml dịch li tâm vào các lỗ thạch đã đục sẵn. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.10 và hình 4.12:
Bảng 4. 10.Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
STT Nồng độ muối (%)
Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml) 1 0 09 0,035 2 0,5 18 0,197 3 1 19 0,220 4 1,5 19 0,223 5 2 19 0,214 6 3 13 0,104 7 5 5 0,050
Hình 4. 12. Đồ thị biểu thị khả năng chịu muối của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối lên tới 5% và sinh trưởng tốt nhất ở nồng độ muối từ 0,5-2%.
Tương tự, chuẩn bị môi trường MPB có nồng độ muối dao động từ 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 5%. Bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn không có tính đối kháng lẫn nhau nên được đánh giá chung trong cùng một môi trường. Cấy vi khuẩn vào các bình tam giác, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 300C để trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 1 ngày. Sau thời gian nuôi, li tâm dịch môi trường 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Nhỏ 0,2 ml dịch li tâm vào các lỗ thạch đã đục sẵn. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.11:
Bảng 4. 11. Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
STT Nồng độ muối (%) Đường kính vòng kháng Xoo (mm) Mật độ đo quang (ở bước sóng 560nm) 1 0 8 0,372 2 0,5 20 1,047 3 1 19 1,116 4 1,5 18 0,989 5 2 19 0,909 6 3 12 0,759 7 5 6 0,642
Từ kết quả trên, các chủng vi khuẩn tuyển chọn cũng có khả năng chịu muối cao, sinh trưởng và sinh hoạt tính mạnh nhất ở nồng độ muối 0,5 -2%
Như vậy, với khả năng sinh trưởng mạnh ở nồng độ muối lên đến 3%, các chủng VSV tuyển chọn có thể thích ứng tốt với những cánh đồng nhiễm mặn ở nước ta.
2.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng và sinh chất đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi sinh vật kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
2.2.1. Nguồn Cacbon
Cacbon có vai trò thiết yếu đối với vi sinh vật và là thành phần cơ bản trong các hợp chất hữu cơ, là cơ chất cung cấp năng lượng cũng như vật liệu để cấu tạo
nên các tế bào vi sinh vật. Do vậy, nó có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của các chủng VSV tuyển chọn.
2.2.1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Đối với xạ khuẩn, thí nghiệm được đánh giá trên môi trường Gauze đã loại bỏ cacbon (tinh bột) được bổ sung thêm một số nguồn cacbon: cám gạo, tinh bột, bột ngô, glucose, đường sacharose, rỉ đường với nồng độ 10 g/l. Cấy 2 chủng xạ khuẩn vào các bình tam giác chứa 100ml môi trường, sau đó đem nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt với thời gian 120h, 150 vòng/phút ở 300C. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 4.13 và bảng 4.12:
Hình 4. 13. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Kết quả trình bày trên hình 4.13 cho thấy 2 chủng xạ khuẩn sinh trưởng được trên cả 6 nguồn cacbon nghiên cứu, trong đó cám gạo, đường saccharose, rỉ đường cho khối lượng sinh khối xạ khuẩn và đường kính vòng kháng khuẩn cao.
Bảng 4. 12. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Nguồn cacbon Mật độ xạ khuẩn (CFU/ml)
Đường kính vòng kháng Xoo (mm) XKBL2 XKBL3 XKBL2 XKBL3 Cám gạo 5,3.108 7,3.108 17 15 Tinh bột 3,6.108 3,1.108 11 11 Bột ngô 1,6.108 4,2.108 9 10 Glucose 1,5.108 2,1.108 8 9 Đường sacharose 8,0.108 6,2.108 14 13 Rỉ đường 1,7.108 2,8.108 12 12
Hình 4. 14. Sự phát triển của xạ khuẩn sau 120h nuôi cấy khi bổ sung các nguồn cacbon
Như vậy, hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn sinh trưởng tốt trong 3 nguồn cacbon: đường saccharose, cám gạo, rỉ đường, trong đó đường saccharose phù hợp cho quá trình lên men nhân giống cấp 1, cấp 2. Rỉ đường phù hợp cho quá trình lên men sản xuất chế phẩm dạng dịch thể, cám gạo phù hợp cho lên men sản xuất chế phẩm dạng bột.
Tương tự như xạ khuẩn, các chủng vi khuẩn cũng được đánh giá trên các nguồn cacbon là: Glucose, Sacharose, tinh bột, rỉ đường, cám gạo, CMC-Na, bột giấy ở nồng độ 10g/l. Cấy 4 chủng vi khuẩn vào các bình tam giác chứa 100ml môi trường, sau đó đem nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt với thời gian 24h, 150 vòng/phút ở điều kiện 300C. Kết quả được trình bày ở hình 4.15:
Hình 4. 15. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Kết quả cho thấy các chủng VK sinh trưởng trên tất cả các nguồn cacbon thí nghiệm. Hầu hết mật độ của các chủng VK sau 24h đều đạt trên 108 CFU/ml trong đó cám gạo và rỉ đường là hai nguồn cacbon rẻ tiền nhưng lại thích hợp nhất cho vi
khuẩn phát triển. Sau 1 ngày nuôi cấy mật độ các chủng PD17, PG13.1 đạt tới 109 CFU/ml. Hai nguồn cacbon CMC-Na và bột giấy mật độ VSV chỉ đạt 106 CFU/ml.
Bảng 4. 13. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae
pv. oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nguồn cacbon Đường kính vòng kháng Xoo (mm) KND PD17 PG13.1 KXT1 Glucose 25 28 23 18 Sacharose 24 29 27 28 Tinh bột 22 25 25 15 Cám gạo 30 30 30 27 Rỉ đường 24 28 30 29 Bột giấy 15 11 11 10 CMC-Na 17 14 10 13
Từ kết quả trên cho thấy các chủng vi khuẩn sinh chất kháng Xoo ở tất cả các nguồn cacbon thí nghiệm. Trong đó cám gạo và rỉ đường là hai nguồn cacbon phù hợp cho sinh trưởng và sinh kháng chất nhất.
Như vậy,các chủng xạ khuẩn và vi khuẩn tuyển chọn có nhu cầu về nguồn cacbon tương đồng, thuận lợi cho quá trình làm môi trường sản xuất chế phẩm.
2.2.1.2. Xác định nồng độ cacbon cần thiết cho các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cacbon đến sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn được thực hiện trên 3 nguồn cacbon: đường sacharose, cám gạo
và rỉ đường với các nồng độ khác nhau: 1 g/l; 5 g/l; 10 g/l; 15 g/l; 20 g/l; 25 g/l; 30 g/l. Do hai chủng xạ khuẩn không có tính đối kháng lẫn nhau nên được đánh giá chung trong cùng một môi trường. Tiến hành cấy giống xạ khuẩn vào các bình tam giác, đem nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt với thời gian 120h, ở điều kiện 300C, lắc 150 vòng/phút. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.14.
Bảng 4. 14. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon tới các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Nồng độ (g/lít)
Mật độ xạ khuẩn (CFU/ml) Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
Cám gạo Rỉ đường Saccharose Cám gạo Rỉ đường Saccharose
1 2,1x106 5,8x105 2,9x106 - - - 5 1,0x107 2,2x107 1,9x107 5 4 5 10 5,1x107 8,0x107 7,7x107 9 9 8 15 1,1x108 1,3x108 1,0x108 10 11 11 20 4,2x108 2,5x108 3,5x108 17 15 17 25 4,5x108 2,2x108 3,0x108 17 16 17 30 3,9x108 2,7x108 2,3x107 17 17 16
Kết quả nghiên cứu trên bảng 3.15 cho thấy nồng độ các bon trong môi trường nằm trong khoảng 20 - 25 g/lít là phù hợp cho sự phát triển của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Thực hiện tương tự đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cacbon đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. Tiến hành cấy giống vi khuẩn vào các bình tam giác, đem nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt với thời gian 24h, ở điều kiện 300C, lắc 150 vòng/phút. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.15:
Bảng 4. 15. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon tới các chủng vi khuẩn tuyển chọn Nồng Nồng độ (g/lít) Mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/ml) Đường kính vòng kháng Xoo (mm) Cám gạo Rỉ đường Saccharose Cám gạo Rỉ đường Saccharose 1 3,1x106 1,8x105 2,3x106 5 0 4 5 1,9x107 2,7x107 4,9x107 10 11 6 10 1,0x108 1,2x108 2,7x108 18 15 10 15 5,1x108 4,1x108 2,9x108 22 15 15 20 1,2x109 4,5x109 3,5x108 23 23 20 25 1,5x109 4,2x109 3,0x109 23 20 22 30 1,7x109 3,8x109 4,1x109 22 21 18
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy nồng độ cacbon trên môi trường nằm trong khoảng 20 - 30 g/lít là phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh chất kháng của các chủng vi sinh vật lựa chọn. Trong đó, saccharose phù hợp cho quá trình lên men nhân giống cấp 1, cấp 2. Rỉ đường phù hợp cho quá trình lên men sản xuất chế phẩm dạng lỏng, cám gạo phù hợp cho lên men sản xuất chế phẩm dạng bột.
2.2.2. Nguồn Nitơ
2.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Nitơ có vai trò thiết yếu trong sự sống của vi sinh vật, là thành phần cơ bản trong các hợp chất hữu cơ như axit amin, protein, các muối nitơ… Do vậy, nó có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của vi sinh vật.
Đối với xạ khuẩn, thí nghiệm được đánh giá trên môi trường Gauze lỏng loại bỏ thành phần nitơ và được bổ sung một số nguồn nitơ như sau: cao nấm men, cao thịt, peptone,axitamin, NH4Cl, KNO3, bột đậu tương, urê với nồng độ 5 g/l. Cấy hai chủng xạ khuẩn vào các bình tam giác, sau đó đem nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt với thời gian 120h, ở điều kiện 300C, lắc 150 vòng/phút. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình 4.16 và bảng 4.16:
Hình 4. 16. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Kết quả nghiên cứu trình bày trên hình 4.16 cho thấy hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn sinh trưởng được trên cả 7 nguồn nitơ nghiên cứu, trong đó có 3 nguồn nitơ: cao nấm men, cao thịt, bột đậu tương có lượng sinh khối xạ khuẩn cao.
Bảng 4. 16. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và hoạt tính kháng
Xanthomonas oryzae pv. oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Nguồn nitơ
Mật độ xạ khuẩn (CFU/ml) Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
XKBL2 XKBL3 XKBL2 XKBL3 Aminoaxit 6,5x108 6,2x108 14 14 Cao thịt 3,6x108 3,1x108 19 23 Bột đậu tương 4,5x108 7,3x108 21 22 Cao Nấm men 4,7x108 3,8x108 17 24 KNO3 1,6x108 2,1x108 10 11 Ure 4,6x107 3,2x108 10 15 NH4Cl 1,8x107 3,0x107 14 17
Xét về hoạt tính kháng Xoo của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn cho thấy dịch canh trường lên men xạ khuẩn có chứa bột đậu tương, cao thịt và cao nấm men cho hoạt tính kháng Xoo cao. Ure là nguồn phân đạm sử dụng nhiều trong sản xuất