2. Phương pháp nghiên cứu
2.6. Đánh giá độc tính của chế phẩm
2.6.1. Phương pháp thử độc cấp
Chuột nhắt trắng dòng BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng khoảng 20-26 gram, không phân biệt giống, được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh
học trong điều kiện tiêu chuẩn về nhiệt độ, ánh sáng, gồm 70 con được chia làm 7 lô (10 chuột/lô), và bị bỏ đói hoàn toàn 16 giờ trước khi được uống chế phẩm
Lô 1: Uống liều 10,0 g/kg trọng lượng cơ thể Lô 2: Uống liều 12,5 g/kg trọng lượng cơ thể Lô 3: Uống liều 15,0 g/kg trọng lượng cơ thể Lô 4: Uống liều 17,5 g/kg trọng lượng cơ thể Lô 5: Uống liều 20,0 g/kg trọng lượng cơ thể Lô 6: Uống liều 22,5 g/kg trọng lượng cơ thể Lô 7: Uống liều 25,0 g/kg trọng lượng cơ thể
Sau khi uống chế phẩm khoảng 1 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72h để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50.
- Công thức tính giá trị LD50
Xác định LD50 được tiến hành theo phương pháp của Karber (trích theo Dodehe Yeo và cs., 2012 và trích theo Shetty Akhila J và cs., 2007) như sau:
LD50 = LD100 - Σa×b/N Trong đó: LD50: LD100: N: a: b: Liều chết 50% động vật thí nghiệm
Liều thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm Số động vật trong một nhóm
Sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp Tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp
2.6.2 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn
Bốn mươi chuột nhắt trắng, không phân biệt giống, khối lượng từ 20-26 gram, nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, được chia làm 3 lô (10 chuột/lô).
Lô 1: uống nước cất (dung dịch hòa mẫu) 0,3 ml/con/ngày. Lô 2: uống chế phẩm liều 1 g/kg/ngày
Lô 3: uống chế phẩm liều 3 g/kg/ngày Lô 4: uống chế phẩm liều 5 g/kg/ngày Thời gian cho uống mẫu là 28 ngày.
Theo dõi dõi biểu hiện bên ngoài của động vật thí nghiệm
Trong thời gian thí nghiệm chuột được theo dõi các biểu hiện bên ngoài như: trạng thái lông, khả năng di chuyển, khả năng thu nhận thức ăn, các hiện tượng đi ngoài (nếu có), phản xạ ánh sáng, âm thanh....
Theo dõi sự thay đổi khối lượng của động vật thí nghiệm
Trong thời gian thí nghiệm chuột được theo dõi sự thay đổi về trọng lượng chuột thí nghiệm 1 tuần/lần (thời điểm trước khi uống chế phẩm gọi là thời điểm ngày 0) để theo dõi quá trình tăng trọng lượng động vật và qua đó đánh giá được tính độc (nếu có) khi cho uống trong thời gian dài liên tục.
2.7. Sản xuất chế phẩm
-Bước 1: Vi sinh vật được hoạt hóa trên môi trường chuyên biệt (MPB, Gauze) ở 300C lắc 150 vòng/phút trong 24h (120h).
-Bước 2: Nhân giống trên canh trường lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trong 72h sau đó kiểm tra mật độ vi sinh vật.
-Bước 3: Lên men để thu chế phẩm dạng lỏng hoặc trộn với chất mang để thu chế phẩm dạng bột.
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1.Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae oryzae pv. oryzae
Nhằm phân lập và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật phù hợp với mục đích nghiên cứu: sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae để ứng dụng làm chế phẩm vi sinh đối kháng. Từ các mẫu thu thập xung quanh vùng rễ cây lúa ở Đông Anh (Hà Nội), Kim Bảng (Hà Nam) tiến hành phân lập các chủng Bacillus trên môi trường MPA, các chủng xạ khuẩn trên môi trường Gauze. Kết quả phân lập được trình bày trong bảng 4.1:
Bảng 4. 1. Số lượng vi sinh vật qua các mẫu đất phân lập (CFU/g)
Kí hiệu mẫu
Số lượng vi sinh vật có trong các mẫu đất phân lập (CFU/g)
Vi khuẩn Bacillus Xạ khuẩn
1 7,2.107 2,8.105 2 7,9.106 1,3.105 3 9,3.107 3,1.104 4 0,8.107 1,8.105 5 1,8.107 9,4.104 6 7,8.107 2,8.105
Hình 4. 1. Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có trong các mẫu Kết quả thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1 thấy, khu hệ vi sinh vật trong các mẫu thu thập được là rất đa dạng về số lượng và chủng loại. Trong hầu hết các mẫu thu thập được, vi khuẩn chiếm số lượng lớn 1,7-7,8x107 CFU/g. Nhóm xạ khuẩn xuất hiện với số lượng lớn nhưng không thấy sự đa dạng về chủng loại khi căn cứ vào màu sắc đặc trưng ở xạ khuẩn. Từ các mẫu đất ở Đông Anh và Hà Nam đã tách được 10 chủng vi khuẩn và 8 chủng xạ khuẩn dựa vào sự khác biệt về đặc điểm hình thái khuẩn lạc.
1.1. Đánh giá tính kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn khuẩn, xạ khuẩn
Từ 10 chủng vi khuẩn và 8 chủng xạ khuẩn phân lập được, kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá lúa bằng phương pháp giếng thạch. Sau khi tinh sạch, các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường Gauze lỏng trong vòng 120h, 150 vòng/phút ở 300C, các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MPB trong vòng 24h, 150 vòng/phút ở 300C, li tâm thu dịch nổi và thử khả năng đối kháng với 6 chủng Xanthomonas gây bệnh bạc lá trên cây lúa. Kết quả đánh giá tính đối kháng của các chủng VSV được trình bày ở bảng 4.2 và 4.3:
Bảng 4. 2. Khả năng kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae của các chủng xạ khuẩn
Tên chủng Đường kính vòng kháng các chủng Xoo (mm)
ST1 ST2 ST3 ST4 ST5 ST6 XKBL2 12 13 16 10 15 14 XK2 0 0 10 0 5 0 XK3 0 0 0 0 0 0 XKH4 11 14 15 14 6 20 XKDA1 0 0 0 0 0 0 XKDA2 0 0 0 0 0 0 XKDA3 0 0 0 0 0 0 XKBL3 15 16 15 11 13 14
Bảng 4. 3 Khả năng kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae của các chủng vi khuẩn
STT Tên
chủng
Đường kính vòng kháng với các chủng Xoo (mm)
ST1 ST2 ST3 ST4 ST5 ST6 1 PD17 12 15 21 32 22 20 2 KXT1 28 23 15 43 22 13 3 KXT2 10 0 12 20 0 8 4 KXT3 23 20 12 25 25 15 5 BS2 12 23 15 28 12 15 6 KND 24 16 19 33 24 22 7 VKPG1 19 15 16 0 0 12 8 PD13.1 32 20 27 35 30 20 9 DA2 0 0 0 0 0 0 10 DA8 0 10 22 16 26 12
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 8 chủng xạ khuẩn, 10 chủng vi khuẩn thí nghiệm chỉ có 2 chủng xạ khuẩn XKBL2, XKBL3 và 4 chủng vi khuẩn KXT1, KND, PD17, PG13.1 có sinh chất đối kháng mạnh với cả 6 chủng vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Các chủng khác không hoặc có sinh chất đối kháng yếu với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Do đó, 2 chủng xạ khuẩn XKBL2, XKBL3 và 4 chủng vi khuẩn KXT1, KND, PD17, PG13.1 được chọn để tiếp tục nghiên cứu.
Hình 4. 2. Hoạt tính đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
1.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 1.2.1. Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 1.2.1. Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Để quan sát đặc điểm hình thái của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn, tiến hành nuôi hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn trên môi trường ISP1 và ISP4 có cắm lam men nghiêng trên mặt môi trường. Sau khi xạ khuẩn phát triển tốt, lam men được lấy ra quan sát dưới kính hiển vi quang học để xác định hình dạng cuống sinh bào tử theo các đặc điểm: S - thẳng, RF - lượn sóng, RA – hình móc câu hay xoắn và xoắn hoàn
toàn. Các mẫu thí nghiệm được nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt ở 300C và quan sát hình thái khuẩn ty tại các thời điểm 7, 14, và 21 ngày. Kết quả quan sát tại 3 thời điểm cho thấy chủng XKBL2 có cuống sinh bào tử dạng S (thẳng), chủng XKBL3 có cuống sinh bào tử dạng RA có hình hình móc câu sau 7 ngày và dạng xoắn sau 14 ngày nuôi cấy (hình 4.3).
Hình 4. 3. Sợi khuẩn ty khí sinh của chủng XKBL2 (A,C,E) và chủng XKBL3 (B,D,F) tại thời điểm 7 – 14 – 21 ngày
Bảng 4. 4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XKBL2 và chủng XKBL3 trên môi trường Gauze và ISP
Môi trườn g
Sau 7 ngày Sau 14 ngày Sau 21 ngày
Màu KTKS MàuKTCC Màu KTKS Màu KTCC Màu KTKS Màu KTCC
XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 XK BL2 XK BL3 Gaus e 1 Trắng Nâu Vàng Nâu, xám Trắng Nâu Trắng, Phớt hồng Nâu, xám Phớt hồng Nâu Phớt hồng Nâu ISP1 Trắng Nâu Vàng, trắng Nâu Trắng Nâu Vàng, Phớt hồng Nâu Phớt hồng Nâu, xám Vàng, Phớt hồng Nâu ISP4 Trắng Nâu Vàng Xám, trắng Phớt hồng Trắng, vàng Xám Phớt hồng Nâu, xám Vàng, Phớt hồng Xám
Ghi chú: KTKS: Khuẩn ty khí sinh ,KTCC: Khuẩn ty cơ chất
Quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tan: các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường GauzeI, ISP1 và ISP4 ở nhiệt độ thích hợp tại các thời điểm 7, 14, 21 ngày. Lấy ra quan sát KTCC, KTKS và sắc tố tan tiết ra môi trường theo phương pháp Shirling và Goblied trên bảng màu của Tresner và Backus và quan sát khả năng hình thành melanin của xạ khuẩn. Kết quả quan sát được là chủng XKBL2 sau 7 ngày nuôi cấy thì KTKS có màu trắng trên cả 3 môi trường. Sau 21 ngày nuôi cấy, màu sắc KTKS đều có màu phớt hồng trên tất cả các môi trường. KTCC sau 21 ngày có màu phớt hồng hoặc vàng trên các môi trường. Chủng XKBL3 khi nuôi cấy được 7 ngày KTKS có màu nâu trên các môi trường Gauze I, ISP1, ISP4; Sau 21 ngày nuôi cấy, KTKS có màu nâu xám trên ISP1 và ISP4, trên các môi trường khác KTKS không thay đổi. Trên môi trường Gauze I và
ISP1 KTCC có màu nâu. Khi nuôi cấy trên các môi trường Gauze và môi trường ISP, cả 2 chủng xạ khuẩn XKBL2 và XKBL3 đều không làm thay đổi màu sắc môi trường, chứng tỏ chúng không có khả năng sinh sắc tố tan và không hình thành sắc tố melanin. Từ các hình thái ban đầu quan sát được cho thấy các chủng xạ khuẩn này đều thuộc nhóm Streptomyces.
1.2.2. Đặc điểm hình thái các chủng Bacillus tuyển chọn
Để quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn, tiến hành nuôi chấm điểm các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường MPA,tiến hành quan sát ở các thời điểm sau 24h và 72h (hình 4.8). Mỗi khuẩn lạc đều phát triển từ một vi khuẩn. Có 3 dạng khuẩn lạc chính: dạng S khuẩn lạc thường nhỏ, màu trong, mặt lồi, bờ đều, bóng; dạng M khuẩn lạc đục, tròn lồi hơn dạng S, quánh hoặc dính; dạng R khuẩn lạc thường dẹt, bờ đều hoặc nhăn nheo, mặt xù xì, khô.
Bảng 4. 5.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chủng vi khuẩn
Đường viền Hình dáng KL Kích thước KL
(mm) Bề mặt
24h 72h 24h 72h 24h 72h 24h 72h
KXT1 Răng
cưa
Hình
hoa Tròn Tròn 8 19 Nhăn Nhăn
PG13.1 Trơn Hình tròn Tròn Tròn 6 7 Trơn bóng Trơn bóng PD17 Răng cưa Hình hoa Mọc lan Mọc
lan 7 9 Nhăn Nhăn
KND Hình cánh hoa Hình cánh hoa Tròn Mọc lan 7 16 Trơn bóng Nhăn
1.3. Đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Với mục đích tuyển chọn các chủng VSV để sản xuất chế phẩm, các chủng tuyển chọn được đánh giá khả năng đồng sinh trưởng bằng phương pháp đường vuông góc. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường thạch gauze với các chủng xạ khuẩn XKBL2, XKBL3 và trên môi trường MPA với các chủng vi khuẩn KND, PD17, PG13.1, KXT1 trong điều kiện 300C, trong 24h (120h), sau đó đem quan sát:
Hình 4. 5. Khả năng đồng sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Hình 4. 6. Khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn Trước khi sản xuất chế phẩm sinh học cần đánh giá đồng thời khả năng đồng sinh trưởng của cả vi khuẩn và xạ khuẩn tuyển chọn trên môi trường dịch thể.
Tiến hành nuôi các chủng vi sinh vật tuyển chọn trên môi trường Gauze lỏng bổ sung cao thịt 5g/l. Sau 3 ngày kiểm tra kết quả. Dịch nuôi vi sinh được phân lập
trên 2 loại môi trường dinh dưỡng chuyên biệt dành cho vi khuẩn, xạ khuẩn là ISP4 và MPA.
Bảng 4. 6. Sinh khối các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong nuôi cấy đồng sinh trưởng
Chủng vi sinh Mật độ tế bào CFU/ml
Vi khuẩn 2,3.108
Xạ khuẩn 3,1.107
Hình 4. 7. Khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn Kết quả kiểm tra cho thấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn sinh trưởng tốt không có tính đối kháng lẫn nhau. Do đó có thể sản xuất chế phẩm có chứa đồng thời cả 2 chủng xạ khuẩn và 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn
2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
2.1.1. Ảnh hưởng của pH
Độ pH của môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Các ion H+, OH- là hai loại ion có tác động lớn nhất đến hoạt động của vi sinh vật, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng của VSV. Vì vậy, việc xác định pH ban đầu và duy trì pH cần thiết trong suốt thời gian sinh trưởng của vi sinh vật là rất quan trọng.
Đối với xạ khuẩn: môi trường Gauze lỏng được điều chỉnh về các mức pH khác nhau: 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 7; 8; 8,5; 9. Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được nuôi trong tủ ấm ổn nhiệt ở 300C, 150 vòng/phút trong 120h, thu mẫu, tiến hành lọc bằng giấy lọc và cân sinh khối khô của xạ khuẩn sau khi sấy đến trọng lượng không đổi.
Đối với vi khuẩn Bacillus, nuôi các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường MPB trong tủ ổn nhiệt ở 300C, 150 vòng/phút trong 24h, đo mật độ quang dịch canh trường ở bước sóng 560nm.
Hình 4. 8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Bảng 4. 7. Ảnh hưởng của pH đến các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Độ pH
Mật độ đo quang ở bước sóng 560nm Đường kính vòng kháng Xoo (mm)
KND PD17 PD13.1 KXT1 KND PD17 PD13.1 KXT1 4,0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,5 0 0 0 0 0 0 0 0 5,0 0,87 0,80 0,59 0,63 8 10 11 8 5,5 0,98 0,99 0,85 0,89 12 14 15 16 6,0 1,12 1,10 1,06 1,14 19 17 20 20 7,0 1,54 1,37 1,29 1,42 20 19 23 21 8,0 1,02 1,27 1,38 1,25 20 18 20 22 8,5 0,68 0,79 0,75 0,79 12 7 11 9 9,0 0 0 0 0 0 0 0 0
Từ kết quả thu được ta thấy pH có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của các chủng VSV tuyển chọn. Hai chủng xạ khuẩn phát triển ở khoảng pH rộng từ 5,5 - 9, sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 7 – 8,5. Ở pH = 4, pH = 4,5 và pH = 5 hai chủng xạ khuẩn không phát triển. Bốn chủng vi khuẩn phát triển ở khoảng pH từ 5 – 8,5, sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 6 – 8. Ở pH trên 8 vừa dưới 5 hầu hết các chủng vi khuẩn đều sinh trưởng kém.
Như vậy cả 2 chủng xạ khuẩn và 4 chủng vi khuẩn được chọn đều có khoảng pH phát triển mạnh tương đối giống nhau từ 6 – 8,5 từ trung tính tới kiềm nhẹ, thích hợp để ứng dụng vào sản xuất.
2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một yếu tố tác động trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và phát triển của VSV, mỗi chủng VSV có một khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau, ở đó chúng có khả năng phát triển và sinh trưởng tốt nhất. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng sinh bào tử mà các xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong giới hạn