theo kỹ thuật PFGE
PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) thường được xem là "tiêu chuẩn vàng - gold standard" trong lựa chọn các phương pháp sinh học phân tử dùng để phân loại vi khuẩn. Đối với kỹ thuật PFGE, chủng vi khuẩn nghiên
46
cứu được nuôi cấy trờn mụi trường lỏng hoặc môi trường thạch, sau đó sẽ hòa vi khuẩn vào thạch agarose lỏng rồi đổ vào những khuôn nhỏ (small molds), kết quả miếng thạch sau khi đổ được cắt tạo ra cỏc nỳt thạch (plugs) nhỏ có chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn được cố định trong thạch sẽ chịu tác dụng của enzym ly giải tế bào để giải phóng toàn bộ phân tử ADN, tiếp theo phân tử ADN này sẽ bị giỏng húa dưới tác dụng phân cắt tại những vị trí đặc hiệu bởi enzym giới hạn. Cỏc nỳt thạch (plugs) chứa ADN sau khi đã được phân cắt được đặt vào những giếng (wells) tương ứng trờn khuụn thạch agarose và tiến hành điện di. Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện thay đổi ở các khoảng được xác định trước sao cho điện trường phải cho phép các đoạn ADN cú kớch thước lớn khoảng 10 - 500 kb phân tách rời được với nhau. Mẫu ADN sau điện di sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium bromide và quan sát dưới đốn cực tím (UV light). Kết quả phân tích ADN trên thạch được chụp ảnh và số liệu có thể được lưu giữ bằng một trong các hệ thống kỹ thuật số thương mại, như sản phẩm của Alpha-Innotech, Bio-Rad, Hitachi hoặc Molecular Dyamics. Phân tích số liệu có thể được thực hiện bởi sử dụng một số phần mềm thương mại sẵn có như Applied Math, Bio- Rad, BioSystematics, Bio-numerics, Media Cybernetics hoặc Scanalytics.
Bảng 1.3: Tiêu chuẩn phân loại theo mức độ liên quan về gen giữa các chủng vi khuẩn phõn tích ADN bằng kỹ thuật PFGE [115].
Số đoạn ADN (band)
khác nhau Mối liên quan
0 Không thể phân biệt được (Indistinguishabble) 2 - 3 Có mối liên quan gần (Closely related) 4 - 6 Có thể có liên quan (Possibly related)
47
7 Khác nhau hoàn toàn (Different)
Tenover và cộng sự [105] đã đưa ra một hệ thống tiêu chuẩn để giải thích những mẫu PFGE trong mối tương quan để xác định sự liên quan giữa các chủng vi khuẩn phân lập được. Trong đó, những chủng vi khuẩn tạo ra các mẫu PFGE tương ứng giống nhau được xem là có nguồn gốc từ một chủng (indistinguishabble). Những chủng vi khuẩn phân lập được khác nhau bởi xảy ra một biến cố về gen (đột biến: đột biến điểm, đột biến mất đoạn hay đột biết thêm đoạn), sẽ được phản ánh bởi sự khác nhau 2 - 3 băng trên thạch điện di và được xem là có mối liên quan gần (closely related). Những chủng vi khuẩn phân lập được khác nhau bởi 4 - 6 băng trên thạch điện di do xuất hiện 2 biến cố độc lập về gen, được xem là có thể có liên quan với nhau (possibly related). Những chủng phân lập được khác nhau bởi 7 băng hoặc nhiều hơn, do xuất hiện sự thay đổi bởi 3 hoặc nhiều hơn biến cố độc lập của gen, được xem là không có mối liên quan (do tần số mỗi đột biến ≤ 10-5
). Vì vậy, tiờu chuẩn này có thể áp dụng được đối các nghiên cứu ở địa phương nhỏ, trong đó sự khác biệt về gen được xem là có giới hạn [107], [115], [116].