2.2.2.2 .Phương phỏp chọn mẫu
2.2.3.Cỏc phương phỏp thu thập số liệu và tiờu chuẩn đỏnh giỏ
Cỏc thụng tin thu thập gồm cỏc thụng tin nhõn trắc, nhúm thụng tin về tỡnh hỡnh bệnh tật (tiờu chảy và nhiễm khuẩn hụ hấp), Cỏc chỉ số về thành phần và số lượng một số vi khuẩn chớ đường tiờu húa của trẻ tại cỏc thời điểm T0, T3 và T6.
2.2.3.1. Cỏc chỉ số nhõn trắc:
- Cỏch tớnh tuổi: Tuổi của trẻ được tớnh bằng cỏch lấy ngày, thỏng, năm điều tra
tra trừ đi ngày thỏng năm sinh của trẻ và phõn loại theo WHO (1995). Vớ dụ: 0 thỏng tuổi được tớnh từ khi trẻ sinh ra đến khi trẻ được 29 ngày, 7 thỏng tuổi được tớnh khi trẻ trũn 7 thỏng tuổi cho đến khi trẻ được 7 thỏng 29 ngày.
- Cõn nặng: Dựng cõn SECA với độ chớnh xỏc 0,1kg. Khi cõn, trẻ chỉ mặc quần ỏo mỏng, khụng mang giày dộp, trọng lượng của bộ quần ỏo sẽ được trừ trước khi ghi kết quả. Kết quả được ghi theo đơn vị kg với một số lẻ.
- Chiều dài nằm: Sử dụng thước đo chiều dài nằm bằng thước gỗ UNICEF với độ chớnh xỏc 0,1 cm. Trẻ được đặt nằm ngửa trờn thước, người trợ giỳp giữ đầu trẻ để mắt trẻ hướng lờn trần nhà, đỉnh đầu chạm vào thanh chắn đầu của thước, giữ đầu gối trẻ để chõn trẻ duỗi thẳng, 2 gút chõn sỏt vào nhau, dịch thanh trượt di động từ dưới lờn cho đến khi chạm và ộp toàn bộ vào mặt bàn chõn của trẻ, đảm bảo thanh trượt vuụng gúc với mặt của thước. Đọc và ghi kết quả với đơn vị là cm và một số lẻ. Tại thời điểm đo, trẻ được đo 3 lần để lấy số đo trung bỡnh. Trong trường hợp 2 trong 3 lần đo cú sự sai khỏc > 0,3cm thỡ Điều tra viờn phải thực hiện đo lại.
- Đỏnh giỏ tỡnh trạng dinh dưỡng: Theo khuyến nghị của WHO, cỏc chỉ tiờu để đỏnh giỏ tỡnh trạng dinh dưỡng là Z-score của nặng theo tuổi (WAZ), chiều dài nằm theo tuổi (HAZ), cõn nặng theo chiều dài nằm (WHZ). Trẻ bỡnh thường khi
cỏc chỉ số WAZ, HAZ, WHZ cú giỏ trị nằm trong khoảng từ -2 đến + 2. Suy dinh dưỡng được ghi nhận khi cỏc chỉ số Z-score của WAZ, HAZ, WHZ < -2.
2.2.3.2. Cỏc chỉ số về đặc điểm đối tượng, tỡnh hỡnh chăm súc và nuụi dưỡng trẻ, tỡnh hỡnh bệnh tật của trẻ trong điều tra ban đầu:
- Phỏng vấn cỏc bà mẹ theo bộ cõu hỏi được thiết kế sẵn để thu thập cỏc số liệu về thực hành chăm súc và nuụi dưỡng trẻ, nuụi con bằng sữa mẹ, ăn bổ sung, sử dụng sữa bột, đỏnh giỏ tỡnh hỡnh mắc bệnh bằng hỏi ghi tiền sử mắc bệnh trong 2 tuần vừa qua. Cỏc Điều tra viờn được tập huấn thống nhất phương phỏp phỏng vấn.
- Tiờu chớ đỏnh giỏ về kiến thức, thực hành nuụi con bằng sữa mẹ, ăn bổ sung theo WHO (2007) [170]
2.2.3.3. Cỏc chỉ số về tỡnh hỡnh sức khỏe và cỏc thụng tin về quỏ trỡnh uống sữa của trẻ trong quỏ trỡnh can thiệp:
- Trẻ được theo dừi cỏc dấu hiệu bệnh tật trong 6 thỏng can thiệp bằng bộ phiếu theo dừi được thiết kế sẵn để thu thập cỏc thụng tin về tỡnh hỡnh sức khỏe, bệnh tật (tiờu chảy, ARI, một số bệnh khỏc) và cỏc thụng tin về quỏ trỡnh uống sữa của trẻ hằng ngày. Cộng tỏc viờn/y tế thụn ghi nhận lại cỏc triệu chứng hoặc dấu hiệu của tiờu chảy/viờm đường hụ hấp vào phiếu theo dừi.
- Tiờu chuẩn để chẩn đoỏn Tiờu chảy: Theo tiờu chuẩn chẩn đoỏn của Tổ chức Y tế thế giới, trẻ được chẩn đoỏn bị tiờu chảy khi trẻ đi đại tiện phõn lỏng hoặc cú mỏu và đi trờn 3 lần/ngày. Nếu cỏc biểu hiện đú hết trong 2 ngày liờn tục thỡ được coi như chấm dứt một đợt tiờu chảy. Trẻ được coi là tiờu chảy kộo dài khi bị tiờu chảy trờn 3 ngày/đợt.
- Triệu chứng sốt được ghi nhận khi trẻ được cộng tỏc viờn đo thõn nhiệt với nhiệt độ cao hơn 37,5 oC.
- Độ đặc lỏng của phõn được đỏnh giỏ theo 3 mức độ: 1. Mềm /tạo thành khuụn 2. Cứng/rắn ( phõn trụng cứng và giống cỏc viờn bi trũn nhỏ (cũn gọi là phõn dờ) và phõn lỏng
- Nụn/trớ: khi cú hiện tượng thức ăn trong dạ dày hoặc ruột bị đẩy ra ngoài ở trẻ - Số lần đại tiện: số lần trẻ đi đại tiện trong ngày
- Màu phõn: được phõn thành 4 loại: màu vàng, màu nõu đen, màu xanh và màu đỏ. Cỏc bà mẹ quan sỏt màu phõn của trẻ để thụng bỏo cho cộng tỏc viờn
- Mựi phõn: được chia thành 2 loại: bỡnh thường và mựi khú chịu. Mựi phõn được đỏnh giỏ theo cảm nhận của người mẹ. Mựi khú chịu khi bà mẹ cảm nhận mựi phõn của con mỡnh cú mựi khú chịu khỏc với mựi phõn bỡnh thường.
- Đầy hơi: trẻ ậm ạch khú chịu, bụng trướng, gừ rất trong và trung tiện nhiều lần. Triệu chứng chỉ được ghi lại sau khi cộng tỏc viờn khỏm và xỏc nhận
- Phần chẩn đoỏn tiờu chảy do nghiờn cứu viờn đỏnh giỏ.
- Khũ khố: tiếng thở bất thường cú õm sắc trầm nghe rừ nhất khi trẻ thở ra, cú thể nghe bằng cỏch ỏp sỏt tai vào miệng trẻ. Bà mẹ thụng bỏo tiếng thở “ bất thường” của trẻ cho cộng tỏc viờn và triệu chứng “ thở khũ khố” chỉ được ghi lại sau khi cộng tỏc viờn kiểm tra và xỏc nhận.
- Nghẹt mũi: khi trẻ cú hiện tượng thở bằng mồm, đặc biệt khi ngủ, ngủ khụng sõu, quấy khúc. Triệu chứng chỉ được ghi lại sau khi được cộng tỏc viờn kiểm tra và xỏc nhận.
- Cỏc triệu chứng của nhiễm khuẩn hụ hấp như chảy nước mũi, ho, sốt, thở khũ khố, nghẹt mũi nếu hết trong hai ngày liờn tục thỡ được coi như chấm dứt một đợt.
2.2.3.4. Cỏc chỉ số về thành phần và số lượng một số vi khuẩn đường tiờu húa của trẻ:
- Cỏch lấy phõn và bảo quản phõn:
+ Mẹ/người chăm súc trẻ được cỏn bộ chuyờn ngành vi sinh hướng dẫn cỏch lấy mẫu phõn đỳng cỏch.
+ Mỗi trẻ sẽ được phỏt một bụ đựng phõn đó rửa sạch và 1 ống nhựa vụ trựng cú thỡa bờn trong để lấy phõn.
+ Sau khi trẻ đi đại tiện vào bụ, bà mẹ trộn đều đống phõn và dựng thỡa vụ trựng lấy khoảng 15g phõn cho ngay vào ống nhựa vụ trựng, rồi đậy chặt nắp lại.
+ Ống nhựa đựng phõn sẽ được cho bảo quản ngay trong phớch lạnh 4-8 oC và trong vũng 15 phỳt được cỏn bộ y tế huyện vận chuyển ngay về Trung tõm y tế huyện để bảo quản đụng lạnh trong tủ đỏ do UNICEF cung cấp ở nhiệt độ -40oC đến -80oC.
+ Sau đú, cỏc ống nhựa đựng mẫu phõn được đúng gúi và bảo quản lạnh trong đỏ khụ, vận chuyển theo đường chuyển phỏt nhanh bằng mỏy bay về Hà Lan để phõn tớch. Việc tỏch ADN được tiến hành tại Labo vi sinh của cụng ty Friesland Campina tại Leeuwarden với việc sử dụng bộ kit QIAampđ theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Cụng ty Qiagen ,Venlo, Hà Lan) và tổng số vi khuẩn, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bifidobacteria, bacteroides, Lactobalicilli, Clostridia, E. Coli, BB12 được định
lượng theo phương phỏp PCR định lượng (quantitative real time PCR) tại Trung tõm hợp tỏc Friesland Campina, Deventer, Hà Lan.
trong quỏ tŕnh chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đớch được nhõn bản đạt đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phỏt được huỳnh quang khi nhận được nguồn sỏng kớch thớch để biết được số lượng bản DNA đớch ban đầu cú trong ống phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn.
Định lượng tuyệt đối được sử dụng để xỏc định số copies của tỏc nhõn đớch cú trong mẫu phõn.
Để cú thể thực hiện phương phỏp định lượng tuyệt đối, tiến hành xột nghiệm real- time PCR của mẫu thử cựng lỳc với cỏc mẫu chuẩn đă biết trước số lượng rồi tớnh ra số copies DNA của tỏc nhõn đớch cú trong ống phản ứng dựa vào đường biển diễn chuẩn xỏc định mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) với số lượng copies DNA đớch ban đầu cú trong ống phản ứng. Cuối cựng xỏc định số copies tỏc nhõn đớch cú trong mẫu phõn dựa vào hệ số pha loăng mẫu và hệ số tỏch chiết DNA của phương phỏp chuẩn bị mẫu trước khi thực hiện PCR.
Cụ thể phương phỏp tớnh toỏn số copies của DNA đớch ban đầu cú trong ống phản ứng dựa vào đường biểu diễn chuẩn như sau:
Đường biểu diễn chuẩn cho được một hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Y = Ct) với log10 của số lượng bản DNA đớch ban đầu cú trong ống phản ứng (X = log10 Sq). Hàm số đú là: Y = [slope (X)] + intercept, và cỏc thụng số slope và intercept đều hiển thị trờn biểu đồ chuẩn.
Từ hàm số này, người làm thớ nghiệm sẽ hiểu được tại sao mỏy tớnh hiển thị được Sq, đú là nhờ tớnh toỏn từ Sq = 10[(Ct - intercept)/slope]
- Mẫu phõn được đỏnh giỏ là (+) với BB12 khi số lượng vi khuẩn BB12≥ 105
2.3. Xử lớ và phõn tớch số liệu:
- Những người tham gia nghiờn cứu và cỏc bà mẹ của trẻ đều khụng biết trẻ thuộc
nhúm nào trong 4 nhúm nghiờn cứu. Code của 225 mẫu sữa được giải mó ra cỏc nhúm trước khi phõn tớch số liệu (sau khi kết thỳc vào số liệu và kiểm tra số liệu)
- Code mó nhúm được lưu giữ tại Hà Lan và chỉ được mở sau khi kết thỳc phõn
tớch thống kờ. Số liệu được phõn tớch tại Hà lan và Việt nam để so sỏnh kết quả. - Số liệu được làm sạch và nhập và xử lý bằng phần mềm EPI-INFO 6.04 và SPSS 13.0
- Số liệu nhõn trắc được nhập và xử lý bằng phần mềm Anthro của WHO 2006 trước khi chuyển vào phần mềm SPSS 13.0 để xử lý.
- Trẻ ăn đủ số lần ăn trờn 90% và tổng lượng sữa trờn 90% được đưa vào thống kờ để đỏnh giỏ tỏc động của can thiệp.
- Kết quả xột nghiệm mẫu phõn của trẻ chỉ được đưa vào thống kờ để đỏnh giỏ tỏc động của can thiệp khi trẻ cú đầy đủ 3 mẫu phõn tại 3 thời điểm T0, T3, T6 (50 mẫu).
- Số liệu được kiểm định về phõn bố chuẩn trước khi sử dụng cỏc phộp thống kờ. - Cỏc test ANOVA được sử dụng để kiểm định sự khỏc biệt giỏ trị trung bỡnh giữa cỏc nhúm nghiờn cứu như cõn nặng, chiều dài nằm, Zscore WAZ, HAZ, WHZ, mức tăng cõn nặng, chiều dài nằm, số lần đi đại tiện…Khi test ANOVA cú p<0,05, tiếp tục sử dụng test Bonferroni để so sỏnh sự khỏc biệt giỏ trị trung bỡnh của từng cặp nhúm nghiờn cứu.
- Những số liệu phõn bố khụng chuẩn như số ngày và số đợt mắc bệnh..,sử dụng test Kruskal Wallis và Mann- Whiney để so sỏnh sự khỏc biệt giữa cỏc nhúm nghiờn cứu và giữa 2 nhúm.
- Test χ2 được sử dụng để so sỏnh sự khỏc biệt giữa cỏc tỷ lệ trong cựng một nhúm tại cỏc thời điểm khỏc nhau hoặc so sỏnh giữa cỏc nhúm cựng thời điểm.
- Chỉ số hiệu quả can thiệp thụ: Được tớnh theo cụng thức:
( )% 100 A B A H = − Trong đú:
H là hiệu quả được tớnh bằng tỷ lệ %.
A là tỷ lệ hiện mắc tại thời điểm bắt đầu can thiệp TO; B là tỷ lệ hiện mắc sau can thiệp tại T6 .
- Chỉ số hiệu quả can thiệp thực: Được tớnh theo cụng thức:
HQCT = H1 - H2 Trong đú:
HQCT là hiệu quả can thiệp
H1 là chỉ số hiệu quả của nhúm can thiệp H2 là chỉ số hiệu quả của nhúm chứng
Cỏc biện phỏp khống chế sai số
- Số liệu nhõn trắc: 2 điều tra viờn của Viện Dinh dưỡng tham gia cõn, đo từ khi bắt đầu nghiờn cứu cho đến khi kết thỳc, sử dụng cựng một loại cõn, thước chuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Điều tra viờn được tập huấn kỹ thuật, thực hiện đỳng theo thường quy và phương phỏp thống nhất để trỏnh sai số do người đo và dụng cụ.
- Số liệu bệnh tật: cộng tỏc viờn được tập huấn cỏch ghi chộp, nhận biết cỏc triệu chứng của bệnh, trạm trưởng y tế cỏc xó và nghiờn cứu viờn kiểm tra số liệu ghi chộp hàng tuần. Hàng thỏng tổ chức họp giao ban và tập huấn lại về cỏch nhận biết và thu thập số liệu về bệnh tật cho cộng tỏc viờn và cỏn bộ tham gia. Cỏc bà mẹ cũng được tập huấn về cỏch nhận biết dấu hiệu bệnh tật để cung cấp cho cộng tỏc viờn, một số triệu chứng chỉ được ghi lại sau khi được cộng tỏc viờn kiểm tra và xỏc nhận như triệu chứng đầy hơi/trướng bụng, thở khũ khố, chảy nước mũi… - Cỏc bà mẹ được tập huấn cỏch thu thập mẫu phõn của trẻ. Cộng tỏc viờn, cỏn bộ tham gia được tập huấn cỏch vận chuyển, qui trỡnh bảo quản mẫu phõn tại thực địa. Mẫu phõn được bảo quản trong đỏ khụ và chuyển sang Labo tại Hà Lan theo đường hàng khụng để phõn tớch.
- Số liệu được làm sạch và cú 02 cỏn bộ chuyờn trỏch nhập vào mỏy tớnh ngay tại thực địa và gửi cho chuyờn gia tại Hà Lan kiểm tra.