Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro cây sâm cau
CẤY IN VITRO CÂY SÂM CAU
Phương pháp nhân giống in vitro sử dụng đỉnh sinh trưởng làm vật liệu
khởi đầu có ưu điểm cây con vẫn giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ, hệ số nhân giống cao hơn so với các phương pháp nhân giống vơ tính truyền thống. Tuy nhiên, do chồi được lấy ngoài tự nhiên nên cần phải khử trùng đảm bảo cho mẫu đưa vào ni cấy sạch, có khả năng phát sinh hình thái.
Đây là giai đoạn đưa đối tượng ni cấy từ ngồi vào điều kiện nuôi cấy vô trùng in vitro. Vì vậy, đối với tất cả các lồi cây trồng khác nhau, việc lựa chọn loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp có ý nghĩa đối với thành cơng của q trình ni cấy in vitro. Giai đoạn này cần đạt được các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại, phân hóa và sinh trưởng tốt.
4.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Các mẫu nuôi cấy được đưa vào khử trùng bằng H2O2, NaOCl là nhóm chất ít gây độc hại cho cơ thể con người. Sau 4 tuần ni cấy, kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 lên mẫu cấy Sâm cau
CTTN Thời gian và nồng độ xử lý nước oxy già (H2O2 )
Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) CT1 15% H2O2+ 5 phút 3,8 83,8 12,4 CT2 15% H2O2+ 10 phút 5,7 72,4 21,9 CT3 15% H2O2+ 15 phút 20,0 38,1 41,9 CT4 15% H2O2+ 20 phút 39,0 28,6 32,4 CT5 15% H2O2+ 25 phút 56,2 26,7 17,1
Qua bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy: khử trùng bằng H2O2 với nồng độ như nhau (15%) trong thời gian khử trùng khác nhau thì tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu sống ở các công thức là khác nhau.
Khi thời gian khử trùng tăng từ 5 phút đến 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễm giảm, nhưng số mẫu chết tăng do thời gian khử trùng lâu. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất là sau 15 phút (41,9%), tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất là sau 5 phút (83,8%). Khi tăng thời gian khử trùng lên 25 phút thì tỷ lệ mẫu chết tăng lên 56,2%, bên cạnh đó khi tăng thời gian khử trùng cho thấy ảnh hưởng yếu đến tỷ lệ mẫu sống. Tỷ lệ mẫu sống rất thấp, chỉ đạt từ 12,4 - 41,9%. Như vậy, tạo vật liệu khởi đầu khử trùng từ chồi bên và chồi đỉnh của cây Sâm cau là tương đối khó, mẫu có tỷ lệ nhiễm cao.
Hình 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ mẫu sống
Từ kết quả trên có nhận xét H2O2 là chất khử trùng bề mặt yếu đối với mẫu cây Sâm cau đưa vào nuôi cấy in vitro, chính vì vậy chúng tôi tiếp tục thử nghiệm với loại chất khử trùng khác NaOCl. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Qua bảng 4.2 và hình 4.2 cho thấy: Khi sử dụng chất khử trùng NaOCl với nồng độ như nhau (2%) trong thời gian khử trùng khác nhau thì sự ảnh hưởng lên
các mẫu cấy Sâm cau là khác nhau, cụ thể:
Khi thời gian xử lý tăng từ 5 đến 15 phút, tỷ lệ mẫu sống tăng theo chiều thuận, sau đó giảm nhẹ ở ngưỡng 20 phút và khi tăng thời gian khử trùng lên 25 phút, tỷ lệ mẫu sống giảm xuống rõ rệt (81,0 - 52,4%). Sau 4 tuần theo dõi, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất (81,0%) ở nồng độ 2% NaOCl (15 phút).
khử trùng tăng dần lên (3,8 - 63,8%). Tỷ lệ chết cao nhất khi khử trùng 2% NaOCl trong khoảng thời gian 25 phút, đạt tới 63,8%.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl lên mẫu cấy Sâm cau
Thời gian và nồng độ xử lý (NaOCl) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) 2% NaOCl trong 5 phút 3,8 80,0 16,2 2% NaOCl trong 10 phút 9,5 46,7 43,8 2% NaOCl trong 15 phút 13,3 5,7 81,0 2% NaOCl trong 20 phút 31,4 16,2 52,4 2% NaOCl trong 25 phút 63,8 14,3 21,9
Khi tăng thời gian khử trùng, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm mạnh, thấp nhất là 5,7% khi khử trùng mẫu trong thời gian 15 phút, sau đó tỷ lệ này lại có xu hướng tăng dần lên.Kết quả cho thấy NaOCl là chất khử trùng có hiệu quả đối với mẫu Sâm cau đưa vào nuôi cấy in vitro.
Hình 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl đến tỷ lệ mẫu sống
Từ kết quả trên, cho thấy lựa chọn 2% NaOCl trong 15 phút cho kết quả tốt nhất khi đưa mẫu Sâm cau vào ni cấy in vitro.
Hình 4.3. Mẫu nảy chồi sau 4 tuần nuôi cấy
4.1.2. Ảnh hưởng của chất chất kích thích sinh trưởng TDZ đến khả năng tạo vật liệu khởi đầu. tạo vật liệu khởi đầu.
Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hịa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro. Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ Cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro. Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin...
Trong thí nghiệm này, loại Cytokinin được sử dụng là TDZ. TDZ là loại Cytokinin ít bị phân hủy bởi các enzym nội sinh, vì vậy trong ni cấy mơ tế bào thực vật, TDZ thường được sử dụng với nồng độ thấp hơn so với các loại Cytokinin khác. Ở nồng độ thấp, TDZ có thể cho hệ số nhân chồi cao hơn các loại Cytoknin khác và ở nồng độ cao TDZ có thể kích thích mẫu cấy hình thành mơ sẹo, chồi bất định hoặc phơi soma.
Để tìm nồng độ phù hợp của TDZ lên sự tạo chồi ban đầu cho mẫu cấy cây Sâm cau, trong thí nghiệm này bố trí 5 nồng độ khác nhau: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Sau 4 tuần ni cấy kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 4.3.
Qua bảng số liệu 4.3 và hình 4.4 cho thấy nồng độ TDZ khác nhau thì tỷ lệ mẫu bật chồi, số lượng chồi và số lá/chồi ở các công thức là khác nhau.
sung 1,5 mg/l TDZ cho tỷ lệ nảy chồi cao hơn cả (80,9%), đồng thời chất lượng chồi cũng khá tốt, chồi mập và khỏe.
Khi nồng độ TDZ tăng làm tăng số chồi và số lá/chồi so với công thức đối chứng. Tuy nhiên, nồng độ tăng, số chồi, số lá/chồi tăng đến mức nồng độ 1,5mg/l TDZ và sau đó giảm khi nồng độ đạt 2,0mg/l TDZ. Số chồi và số lá/chồi đạt cao nhất ở nồng độ 1,5mg/l lần lượt là 3,1 chồi và 2,7 lá/chồi và thấp nhất ở nồng độ 0 mg/l TDZ lần lượt là 1,2 chồi và 1,5 lá/chồi.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng TDZ đến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban đầu (sau 4 tuần nuôi cấy)
Nồng độ TDZ (mg/l) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) Số chồi (chồi) Số lá/chồi (lá) Chất lượng chồi
0 (Đ/C) 44,7 1,2d 1,5d Chồi sinh trưởng kém
0,5 62,9 2,0c 2,1c Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình 1,0 70,5 2,8b 2,5b Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình
1,5 80,9 3,1a 2,7a Chồi sinh trưởng ở mức độ khá
2,0 79,0 1,3d 1,6d Chồi sinh trưởng kém
CV% 5,4 4,9
LSD0.05 0,2 0,18
Ghi chú: Nền môi trường MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính pH 5,5.
Đối với chỉ tiêu số chồi: Số chồi dao động từ 1,2 đến 3,1 chồi. Ở nồng độ 1,5 mg/l có số chồi đạt cao nhất là 3,1 chồi. Trong khi đó ở cơng thức khơng bổ sung (đối chứng) có số chồi đạt thấp nhất là 1,2 chồi. Khi bổ sung nồng độ TDZ với mức 0,5; 1,0; 1,5mg/l đều có số chồi cao hơn công thức đối chứng. Cơng thức cịn lại có số chồi tương đương công thức đối chứng. Sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy 95%.
Khi tăng nồng độ TDZ lên quá 1,5 mg/l thì số chồi có hiện tượng giảm dần, có thể do nồng độ cao ức chế sự phát sinh chồi Sâm cau.
Đối với chỉ tiêu số lá/chồi cho thấy: Số lá/chồi dao động từ 1,5 - 2,7 lá. Trong đó, ở nồng độ 1,5 mg/l có số lá/chồi đạt cao nhất là 2,7 lá; công thức (Đ/C) không bổ sung TDZ có số lá/chồi thấp nhất (1,5 lá). Khi bổ sung nồng độ TDZ
với mức 0,5; 1,0; 1,5mg/l đều có số lá/chồi cao hơn cơng thức đối chứng. Cơng thức cịn lại có số lá/chồi tương đương công thức đối chứng. Các kết quả thu được có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy α = 0,05.
Chồi sinh trưởng mạnh mẽ khi tăng dần nồng độ TDZ và cho chất lượng chồi tốt nhất ở nồng độ 1,5 mg/l, tuy nhiên vượt quá ngưỡng nồng độ này, chồi cây có biểu hiện sinh trưởng kém hơn.
Hình 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến số chồi của mẫu cấy ban đầu của mẫu cấy ban đầu
Từ phân tích trên nhận thấy nồng độ TDZ thích hợp nhất để bổ sung vào môi trường MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính, pH 5,5 với mục đích tạo chồi từ mẫu cấy ban đầu là 1,5 mg/l.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2010) khi sử dụng TDZ ở nồng độ 1,5 mg/l có ảnh hưởng rất tốt tới khả năng nhân chồi và chất lượng chồi của Khoai môn sọ.