3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) được thu thập ở Sơn La.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu Sâm cau:Cây Sâm cau được thu thập ở Sơn La.
Hình 3.1. Mẫu Sâm cau đưa vào nuôi cấy in vitro
- Môi trường nuôi cấy:
+ Môi trường nuôi cấy: Murashige & Skoog (MS) được coi như là một môi trường cơ bản, được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật. MS được phát
minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige và Skoog Folke K. vào năm 1962 trong quá trình tìm kiếm của Murashige cho một loại hormone mới.
+ Các chất kích thích sinh trưởng được sử dụng trong thí nghiệm là: IBA
(Indole - 3 - butyric acid), TDZ (thidiazuron). Ngoài ra trong môi trường nuôi cấy
còn bổ sung phloroglucinol (PG), AgNO3 và các phụ gia khác như tảo Spirulina,
đường, nước dừa, than hoạt tính...
IBA là hormone thuộc nhóm Auxin. Trong nuôi cấy mô thực vật IBA và các Auxin khác được sử dụng để bắt đầu sự hình thành rễ trong ống nghiệm trong một quy trình gọi là vi nhân giống. Xuất xứ: Đức.
TDZ có hoạt tính giống như Cytokinin, đẩy nhanh tiến trình trưởng thành, được cấp bằng sáng chế vào đầu những năm 1980 bởi công ty Đức Schering AG. Xuất xứ: Đức.
- Giá thể:
Các giá thể trồng cây sử dụng trong nghiên cứu: Vụn xơ dừa, vụn xơ dừa + trấu hun (50:50), mùn rừng, mùn rừng + vụn xơ dừa (70:30).
- Các loại phân bón sử dụng:
Hình 3.2. Growmore (N: P: K = 30: 10: 10)
Hình 3.3. B1 Thái Lan Hình 3.4. Atonik 1.8 SL
+ Growmore (N: P: K = 30: 10: 10) có nguồn gốc từ Mỹ, nhập khẩu từ Công ty
TNHH Tư vấn - Thương mại Mai Huy. Thành phần: N: 30%; P2O5: 10%; K2O: 10%;
Cu: 0,05%; Fe: 0,10%; Mn: 0,05%; Mo: 0,0005%; Zn: 0,05%, giúp cây đẻ nhánh khoẻ, ra lá tốt.
Huy; Thành phần: P2O5: 2,0%; Fe: 0,10%; Fe - EDTA: 0,10%; B1: 0,10 %; α NAA: 0,04%, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt.
+ Atonik 1.8 SL: được đăng kí bởi Ashi chemical MFG Co., Ltd, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển cho cây.
- Chất khử trùng nấm, bệnh:
Daconil 75WP: có nguồn gốc từ Nhật Bản, đóng gói và phân phối bởi công ty TNHH Việt Thắng; Hoạt chất Chlorothalonil: 75%; là thuốc trừ bệnh chống nấm diệt khuẩn, phổ tác dụng rộng.
- Trang thiết bị:
+ Buồng cấy vô trùng (Bioiogical safety Cabinets); Nồi hấp khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy Nhật Bản; Cân điện tử của Đức; Máy đo pH; Tủ sấy…
+ Bình tam giác có kích thước từ 250ml - 500ml, pipet loại 1ml, dụng cụ nuôi cấy, phễu lọc, đũa thủy tinh…
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro cây Sâm cau;
- Nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Sâm cau; - Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh;
- Nghiên cứu kỹ thuật trồng cây Sâm cau trong vườn ươm.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp nhân giống in vitro 3.5.1. Phương pháp nhân giống in vitro
Các chất kích thích sinh trưởng được sử dụng trong thí nghiệm nuôi cấy và nhân nhanh là:
- IBA (Indole - 3 - butyric acid), TDZ (thidiazuron) nồng độ dao động từ 0 - 2 mg/l tùy theo mục đích thí nghiệm.
- Các chất khác như AgNO3, phloroglucinol (PG) và chất phụ gia như: tảo
Spirulina, đường, nước dừa, than hoạt tính...
* Phương pháp lấy mẫu, khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu:
rửa sạch bằng nước xà phòng và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 2 - 3 lần. Tiếp
theo khử trùng mẫu bằng oxy già (15% H2O2), hypochlorite - Na (2% NaOCl) rửa
lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng, sau đó cắt lấy đỉnh sinh trưởng và cấy trên các môi trường thí nghiệm: Murashige & Skoog bổ sung 30 g/1 sucrose, 5,5 g/1 agar, 200 ml/l nước dừa, 1g/l than hoạt tính, pH 5,5 và bổ sung chất kích thích sinh trưởng TDZ ở các nồng độ khác nhau. Những chồi non tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng được dùng làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Phương pháp nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh:
Các chồi non tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng được cấy trên môi trường cơ bản MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt
tính, bổ sung TDZ, IBA, phloroglucinol (PG), AgNO3, tảo Spirulina…để khảo
sát khả năng nhân nhanh chồi.
Các chồi Sâm cau in vitro có 2 - 3 lá, chồi chưa có rễ, chồi khỏe mạnh được tách ra và cấy sang môi trường ra rễ MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa, pH 5,5 có bổ sung IBA để khảo sát khả năng hình thành rễ.
+ Điều kiện nuôi cấy: Cường độ ánh sáng: 2400 - 3000 lux, nhiệt độ phòng nuôi: 18 - 250C, số giờ chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
* Phương pháp đưa cây ra vườn ươm:
Các cây sau khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn chiều cao khoảng 5 - 6 cm, có khoảng 3 - 4 lá, 5 - 7 rễ để bình cây ra ngoài vườn ươm 5 ngày. Các cây sau khi đưa ra khỏi ống nghiệm được rửa sạch agar, rải đều trên khay sạch để trong 1 giờ, rồi trồng vào chậu nhựa với kích thước chậu (12 x 18cm) trên các giá thể và phân bón khác nhau, cây được trồng vào vụ Xuân (15/2) để khảo sát khả năng sinh trưởng của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm.
+ Các thí nghiệm ngoài vườn ươm: Được đặt trong nhà lưới của Phòng thí nghiệm Ứng dụng Y sinh công nghệ cao, Viện Ứng dụng Công nghệ.
3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.5.2.1. Nghiên cứu khử trùng và tạo vật liệu khởi đầu
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 và NaOCl tới
Bảng 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 và NaOCl
Công thức
Thời gian và nồng độ xử lý nước oxy già (H2O2 )
Công thức Thời gian và nồng độ xử lý (NaOCl) CT1 15% H2O2+ 5 phút CT1 2% NaOCl + 5 phút CT2 15% H2O2+ 10 phút CT2 2% NaOCl + 10 phút CT3 15% H2O2+ 15 phút CT3 2% NaOCl + 15 phút CT4 15% H2O2+ 20 phút CT4 2% NaOCl + 20 phút CT5 15% H2O2+ 25 phút CT5 2% NaOCl + 25 phút
Thí nghiệm gồm 5 công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất chất kích thích sinh trưởng TDZ đến khả năng tạo vật liệu khởi đầu.
CT1 (Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính, pH 5,5)
CT2: Nền + 0,5 mg/l TDZ CT3: Nền + 1,0 mg/l TDZ CT4: Nền + 1,5 mg/l TDZ CT5: Nền + 2,0 mg/l TDZ
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy.
3.5.2.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng (TDZ + IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi
CT1 (Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ, pH 5,5)
CT3: Nền + 0,5 mg/l IBA CT4: Nền + 0,75 mg/l IBA CT5: Nền + 1,0 mg/l IBA
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phloroglucinol (PG) đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau
CT1(Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l IBA, pH 5,5)
CT2: 0,5mg/l PG CT3: 1,0 mg/l PG CT4: 1,5 mg/l PG CT5: 2,0 mg/l PG
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của AgNO3 đến khả năng nhân nhanh chồi
Sâm cau
CT1(Đ/C): Nền (MS + 30g/l đường + 200ml/l nước dừa + 5,5 g/l thạch + 1g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l IBA, pH 5,5).
CT2: 0, 5mg/l AgNO3
CT3: 1,0 mg/l AgNO3
CT4: 1,5 mg/l AgNO3
CT5: 2,0 mg/l AgNO3
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng tảo Spirulina đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau
CT1(Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa +
CT2: Nền + 50 mg/l tảo Spirulina
CT3: Nền + 100 mg/l tảo Spirulina
CT4: Nền + 150 mg/l tảo Spirulina
CT5: Nền + 200 mg/l tảo Spirulina
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy.
3.5.2.3. Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của IBA đến tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Khi các chồi có khoảng 2 - 3 lá thì chuyển sang giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh. CT1 (Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính, pH 5,5)
CT2: Nền + 0,5 mg/l IBA CT3: Nền + 1,0 mg/l IBA CT4: Nền + 1,5 mg/l IBA CT5: Nền + 2,0 mg/l IBA
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy.
3.5.2.4. Nghiên cứu đưa cây Sâm cau in vitro ra vườn ươm
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của giá thể khác nhau đến sinh trưởng và phát triển của cây in vitro ngoài vườn ươm
CT1: Vụn xơ dừa
CT2: Vụn xơ dừa + trấu hun (50:50) CT3: Mùn rừng CT4: Mùn rừng + Vụn xơ dừa (70:30) - Sơ đồ bố trí thí nghiệm: CT1 CT2 CT3 CT4 CT3 CT1 CT4 CT2 CT4 CT3 CT2 CT1
Thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với 3 lần nhắc lại. Mỗi công thức thí nghiệm 30 cây, 6 chậu/công thức, mỗi tuần theo dõi 1 lần, thời gian theo dõi 10 tuần. Các cây con khi trồng được tưới nước 1 - 2 lần/ngày tùy theo điều kiện thời tiết.
Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng một số loại phân bón qua lá đến sinh trưởng và phát triển của cây in vitro ngoài vườn ươm
CT1 (Đ/C): Nước lã CT2: B1 - Thái Lan CT3: Growmore Mỹ (30:10:10) CT4: Atonik 1.8 SL - Sơ đồ bố trí thí nghiệm: CT2 CT4 CT1 CT3 CT3 CT1 CT4 CT2 CT4 CT2 CT3 CT1
Thí nghiệm tiến hành với 4 công thức, các cây được trồng trên đất mùn + vụn xơ dừa (70:30). Các cây được tưới giữ ẩm bằng nước lã trong 02 tuần. Sau 02 tuần sử dụng các loại chế phẩm dinh dưỡng, định kỳ 1tuần/lần theo từng công thức thí nghiệm. Phun ướt toàn bộ thân lá, lượng phun 0,5g/l. Các ngày không tưới phân bón đảm bảo ẩm độ của giá thể trồng bằng nước sạch.
Thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với 3 lần nhắc lại. Mỗi công thức thí nghiệm 30 cây, 6 chậu/công thức, mỗi tuần theo dõi 1 lần, thời gian theo dõi 8 tuần sau trồng.
3.5.3. Các chỉ tiêu theo dõi
* Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu đưa vào x 100% - Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu đưa vào x 100% - Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Tổng số mẫu tạo chồi/Tổng số mẫu đưa vào x 100% - Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ/Tổng số chồi theo dõi x 100% - Chiều cao cây (cm) = Tổng chiều cao các cây/Tổng số cây theo dõi - Số lá/chồi (lá) = Tổng số lá thu được/Tổng số chồi
- Số rễ/cây (rễ) = Tổng số rễ thu được/Tổng số chồi
- Số chồi/mẫu (chồi) = Tổng số chồi thu được/Tổng số chồi theo dõi
* Các chỉ tiêu theo dõi trong vườn ươm:
- Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống/Tổng số cây đưa ra trồng ngoài vườn ươm x 100%
- Chiều cao cây (cm) = Tổng chiều cao của các cây theo dõi/Tổng số cây theo dõi. Chiều cao cây được đo từ mặt chậu đến đỉnh sinh trưởng của cây.
- Số lá TB/cây (lá) = Tổng số lá của các cây trong thí nghiệm/Tổng số cây thí nghiệm.
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp thống kê sinh học để phân tích các số liệu thí nghiệm trên chương trình EXCEL và IRRISTAT 5.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU KHỬ TRÙNG TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO NUÔI
CẤY IN VITRO CÂY SÂM CAU
Phương pháp nhân giống in vitro sử dụng đỉnh sinh trưởng làm vật liệu khởi đầu có ưu điểm cây con vẫn giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ, hệ số nhân giống cao hơn so với các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống. Tuy nhiên, do chồi được lấy ngoài tự nhiên nên cần phải khử trùng đảm bảo cho mẫu đưa vào nuôi cấy sạch, có khả năng phát sinh hình thái.
Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy từ ngoài vào điều kiện nuôi cấy vô trùng in vitro. Vì vậy, đối với tất cả các loài cây trồng khác nhau, việc lựa chọn loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp có ý nghĩa đối với thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đạt được các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại, phân hóa và sinh trưởng tốt.
4.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Các mẫu nuôi cấy được đưa vào khử trùng bằng H2O2, NaOCl là nhóm chất
ít gây độc hại cho cơ thể con người. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 lên mẫu cấy Sâm cau
CTTN Thời gian và nồng độ xử lý nước oxy già (H2O2 )
Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) CT1 15% H2O2+ 5 phút 3,8 83,8 12,4 CT2 15% H2O2+ 10 phút 5,7 72,4 21,9 CT3 15% H2O2+ 15 phút 20,0 38,1 41,9 CT4 15% H2O2+ 20 phút 39,0 28,6 32,4 CT5 15% H2O2+ 25 phút 56,2 26,7 17,1
Qua bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy: khử trùng bằng H2O2 với nồng độ như
nhau (15%) trong thời gian khử trùng khác nhau thì tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu sống ở các công thức là khác nhau.
Khi thời gian khử trùng tăng từ 5 phút đến 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễm giảm, nhưng số mẫu chết tăng do thời gian khử trùng lâu. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất là sau 15 phút (41,9%), tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất là sau 5 phút (83,8%). Khi tăng thời gian khử trùng lên 25 phút thì tỷ lệ mẫu chết tăng lên 56,2%, bên cạnh đó khi tăng thời gian khử trùng cho thấy ảnh hưởng yếu đến tỷ lệ mẫu sống. Tỷ lệ mẫu sống rất thấp, chỉ đạt từ 12,4 - 41,9%. Như vậy, tạo vật liệu khởi đầu khử trùng từ chồi bên và chồi đỉnh của cây Sâm cau là tương đối khó, mẫu có tỷ lệ nhiễm cao.
Hình 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ mẫu sống
Từ kết quả trên có nhận xét H2O2 là chất khử trùng bề mặt yếu đối với mẫu cây Sâm cau đưa vào nuôi cấy in vitro, chính vì vậy chúng tôi tiếp tục thử