Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
BẰNG NI CẤY MƠ TẾ BÀO
Nhân giống bằng ni cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, q trình này có thể chia thành các nhân tố sau:
2.3.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem là vấn để quyết định sự thành bại của q trình ni cấy. Mơi trường ni cấy được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hố mơ trong suốt q trình ni cấy in vitro. Cho đến nay, đã có nhiều mơi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS, VW, RE, N6…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích ni cấy.
Mơi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:
+ Nguồn các bon: Trong ni cấy mơ, các tế bào chưa có khả năng quang
hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô. Nguồn các bon ở đây là các loại đường khoảng 20 - 30 mg/l có tác dụng giúp mơ tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngồi ra nó đóng vai trị là chất thẩm thấu chính của mơi trường. Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994).
+ Nguồn Nitơ: Tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát
triển mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4
+ và NO3-. Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4 + .
Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” mơi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất.
+ Các nguyên tố đa lượng: Là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S,
Mg, Ca…cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng ni cấy. Nhìn chung, các ngun tố này được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm.
Có nhiều mơi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau có thể lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, cịn mơi trường giàu kali sẽ thúc đẩy q trình trao đổi chất mạnh hơn.
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, Bo, Zn,…là các nguyên tố rất quan
trọng do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây
+ Các vitamin: Mặc dù cây ni cấy mơ có thể tự tổng hợp được vitamin,
nhưng không đủ cho nhu cầu. Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin nhóm B được bổ sung vào mơi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l.
+ Bột tảo Spirulina có chứa các nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây như các vitamin, các amino acid, các chất khoáng đa lượng, vi lượng (Dal et al., 2014). Bổ sung bột tảo Spirulina ở nồng độ 50 mg/l có tác
động hiệu quả đến tỷ lệ sống của chồi và số chồi đạt của lan Paphiopedilum delenatii (Nguyễn Thị Cúc và cs., 2014).
2.3.2. Các chất điều hịa sinh trưởng
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hồ sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trị quan trọng trong q trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngồi ra cịn có ảnh hưởng đến q trình lão hố mơ và nhiều q trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic axít. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả ni cấy.
+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid),…
trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hố rễ, hình thành mơ sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ .
+ Cytokinin: Được bổ sung vào mơi trường chủ yếu để kích thích sự phân
chia tế bào và quyết định sự phân hố chồi bất định từ mơ sẹo và cơ quan. Hợp chất thường sử dụng là: Thidiazuron (TDZ)...Trong ni cấy mơ để kích thích sự
nhân nhanh người ta thường sử dụng Cytokinin với nồng độ 10-6 - 10-4 M (Lê Văn Chi, 1992).
Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường. Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mơ tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6.
2.3.3. Môi trường vật lý
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các mơ ni cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thơng qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng có vai trị quan trọng trong q trình phát triển của mơ ni cấy. Với đa số các lồi cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8 - 12h/ngày. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy.
Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mơ sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi. Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mơ nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux.
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, cịn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mơ sẹo. Chính vì vậy mà trong phịng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mơ ni cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200C/150C
hoặc 200C/180C tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí cịn thấp hơn. Ở nhiệt
độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Cịn ở nhiệt độ cao lại tạo nhiều tế bào khơng có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ 25 - 300C và ban đêm từ 17 - 200C.
+ Độ ẩm: Trong các bình ni cấy thì độ ẩm tương đối ln bằng 100% để đảm bảo sự phát sinh phát triển bình thường của cây nuôi cấy mô.
2.3.4. Vật liệu nuôi cấy
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mơ chun hố đều có tính tồn năng, nghĩa là đều có thể ni cấy thành cơng. Thực tế cho thấy các lồi tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ ni cấy thành cơng khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng ni cấy thành cơng càng cao. Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995).
2.3.5. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của q trình ni cấy in vitro. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu ni cấy
hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô ni cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn
sau sẽ bị ngừng lại. Do đó, trong tồn bộ q trình ni cấy in vitro cần đảm
bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vơ trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng, bàn nuôi cấy vô trùng.
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, mơi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh.
Các thiết bị như: nồi hấp, tủ sấy, buồng, bàn cấy vô trùng...đều phải đảm bảo vô trùng để mẫu được sạch, tinh khiết trước khi vào nuôi cấy.