Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2. Đối tượng nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội. 3.2.2. Cao khô dược liệu Bồ công anh
Thân lá cây Bồ Công Anh (Lactuca indica L.), khô đã qua sơ chế được thu mua. Sơ chế lá theo quy trình sau: Cây tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) sau đó được sấy hoặc phơi khô ở 400C. Mẫu khô được nghiền thành bột mịn (<0,5mm). Bột lá đựng trong túi nilong bảo quản trong bình hút ẩm.
Bột dược liệu Bồ Công Anh được chiết với các dung môi bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với cùng một tỷ lệ (5g bột dược liệu/50ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần. Sau 72 giờ thu dịch chiết lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1. Thu dịch chiết đem cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi. Tới khi khối lượng của bình cô quay không đổi đem cân để tính hiệu suất tách chiết của các dung môi. Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản trong tủ mát 40C để thử hoạt tính và khả năng ức chế vi khuẩn.
3.2.3. Vi khuẩn nghiên cứu
- Vi khuẩn Staphylococus spp. và Streptococus spp.phân lập từ dịch viêm tử cung bò được cung cấp từ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (LAS – NN54; ISO 17025:2005).
3.2.4. Nano bạc
- Nano bạc có nồng độ gốc 100 ppm, 90% các hạt nano bạc có kích thước 20 - 25 nm do bộ môn Sinh học khoa Công nghệ Sinh học cung cấp.
3.2.5. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
3.2.5.1. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có: tủ sấy, lò v sóng; tủ ấm nuôi vi khuẩn, tủ nuô v khuẩn lỏng lắc; cân phân tích; nồi hấp khử trùng autoclave; box cấy vô trùng; máy đo pH, máy l tâm, máy đo quang phổ, máy cô quay chân không.
Một số dụng cụ cần thiết như: Bình ống nghiệm, pipet man, đĩa petri, ống nghiệm, eppendof, đèn cồn, cốc thủy t nh, g á ống ngh ệm, bình định mức, ống ngh ệm.
3.2.5.2. Hóa chất - môi trường
+ Hóa chất
Các dung môi chiết: axit acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, nước cất, aceton nitril 50%, aceton nitril 100%.
Dung môi pha chất tan: Dimethyl sulphoxit (DMSO).
Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết.
+ Môi trường Luria–Bertani (LB)dạng lỏng, được hấp tiệt trùng trong các
bình tam giác.
+ Môi trường LB rắn, được hấp tiệt trùng để nguội tới 400- 500C, đổ vào đĩa
petri có đường kính 10 cm, với độ dày là 4 ± 0,2 mm. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khảo sát bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa ở một số địa phương thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội.
- Phân lập và giám định thành phần vi khuẩn trong dịch tử cung của bò sữa.
- Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau.
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò.
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcusspp. và Staphylococcus spp. của Nano bạc.
- Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro khi phối hợp nano bạc và cao dịch chiết Bồ Công Anh.
Khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung: Tiến hành kiểm tra tỷ lệ bò sữa bị viêm tử cung tại 03 xã thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội.
Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò: Tiến hành lấy mẫu dịch viêm tử cung bò trên đàn bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc 03 xã thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội. Chuyển các mẫu sữa về phòng thí nghiệm của Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung bò bằng phương pháp phân lập vi
khuẩn: Vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung được phân lập theo phương pháp thường
qui (Nguyễn Như Thanh và Nguyễn Bá Hiên. 2001). Nuôi cấy các dịch cần chẩn đoán vào các môi trường thông thường và môi trường đặc biệt để xác định các đặc tính nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của từng loại vi khuẩn. Đối chứng là những mẫu dịch tử cung của bò khoẻ mạnh, bình thường trong cùng đàn.
Phương pháp pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml: Lấy 1g cao cô toàn phần
pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococus aureus. và Streptococus spp. trên môi
trường rắn và lỏng: Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa
petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn).
Xác định mật độ vi khuẩn: Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600ɳm.
+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm. Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.
Phương pháp pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm
nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml. Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml.
Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật.
Định tính saponin trong thực vật.
Tính tạo bọt là tính chất đặc trưng của sapon n. Chúng tô dựa vào h ện tượng tạo bọt để định tính sự có mặt của Sapon n trong dịch ch ết.
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 5 g ọt dịch ch ết ở
mỗ loạ , thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận thực vật có chứa saponin.
3.3.1. Định tính flavonoid
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để
lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.
- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài
giọt dung dịch FeCl3 5%. Sẽ xuất hiện tủa xanh đen. 3.3.2. Định tính tanin
- Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung
dịch FeCl3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen.
- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung
dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng. 3.3.3. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
- Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng.
- Tác dụng với thuốc thử Bouchardat (100ml nước, 2.5g I2, 5g KI): Lấy
một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu.
3.3.4. Định tính carotenoid
Thêm vào dịch chiết vài giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu có carotenoid, dung dịch có màu xanh dương.
3.3.5. Định tính polyphenol
Cho vào mỗi ống nghiệm 1 mẫu cao khô mỗi loại dịch chiết, thêm 2ml nước cất và hòa tan đều. Nhỏ vào mỗi ống 1ml FeCl3 2%, lắc đều. Dung dịch chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ có Polyphenol.
3.3.6. Định tính đường khử
Cho vào mỗi ống nghiệm một ít cao khô mỗi loại dịch chiết. Cho 2 ml nước cất vào mỗi ống, hòa tan, lắc đều. Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống, nếu có kết tủa đỏ gạch chứng tỏ có đường khử.
3.3.7. Định tính chất nhầy
Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ
xuất hiện tủa bông.
3.3.8. Định tính coumarin
Dựa vào độ tan khác nhau khi đóng và mở vòng lacton: cho vào ống
nghiệm mỗi ống 1 - 2 ml dịch chiết. Ống thứ nhất cho thêm 0.5 ml NaOH 10%, đun cách thủy cả 2 ống (ống có coumarin thường có màu vàng xuất hiện). Để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất. Nếu ống 1 đục hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà độ đục hoặc kết tủa như ống 2 thì sơ bộ xác định có coumarin.
3.4. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN VITRO CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN
* Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các đĩa thạch
Meuller-hinton có nồng độ nano bạc khác nhau. * Tiến hành:
Mật độ vi khuẩn đem cấy trộn là 108 tế bào/ml.
Nồng độ dung dịch nano đem cấy trộn là 100 ppm (nồng độ gốc).
Pha loãng nano theo dãy pha loãng như đã nêu ở trên (sử dụng nước đề ion để pha loãng nano), bổ sung vào mỗi ống 10 µl dịch khuẩn. Sau đó, ngâm các dịch khuẩn trong các nồng độ nano ở 2h, 4h, 8h.
* Tiến hành thử nghiệm: Sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch (Carvahol và cộng sự, 2011). Sau thời gian 2h, 4h, 8h lấy 100µl nano bạc được pha loãng ở các nồng độ khác nhau đã được bổ sung dịch khuẩn cấy chang trên đĩa thạch để quan sát khả năng ức chế vi khuẩn.
Nuôi tủ ấm 300/24 giờ, lấy ra đọc kết quả: Xác định nồng độ nano pha loãng thấp nhất còn có khả năng ức chế vi khuẩn.
3.5. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT THỰC VẬT KHI PHỐI TRỘN VỚI NANO BẠC CỦA DỊCH CHIẾT THỰC VẬT KHI PHỐI TRỘN VỚI NANO BẠC
Phối trộn dịch chiết với nano bạc: Hút 5ml dịch chiết thực vật được tách chiết, ở các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào các ống nghiệm, tiếp tục hút 5ml nano bạc ở nồng độ ức chế tối thiểu cho lần lượt vào các ống nghiệm này, lắc đều.
Hút 100µl hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc nhỏ lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được chang khuẩn. Sau đó nuôi ủ ở điều kiện 370C, sau 24h lấy ra đo đường kính vòng vô khuẩn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc dựa vào đường kính vòng vô khuẩn.
Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TỶ LỆ MẮC BỆNH VIÊM TỬ CUNG TRÊN BÒ SỮA Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG THUỘC HUYỆN BA VÌ, THÀNH PHỐ HÀ NỘI
Theo số liệu thống kê đến tháng 10/2016, số lượng bò sữa của huyện Ba Vì đạt 8,1 nghìn con; chiếm 65% tổng đàn bò sữa toàn thành phố Hà Nội, sản lượng sữa đạt 26,5 nghìn tấn, tập trung chủ yếu tại xã Vân Hòa, Yên Bài, Tản Lĩnh. Hình thức chăn nuôi chủ yếu là nông trại hộ gia đình, bình quân từ 5-6 con/hộ.
Với mục đích đánh giá hiện trạng bệnh viêm tử cung sau đẻ của đàn bò sữa nuôi tại các xã có số lượng bò lớn thuộc huyện Ba Vì thành phố Hà Nội chúng tôi tiến hành điều tra bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp người chăn nuôi kết hợp với việc thăm khám trực tiếp và sử dụng phương pháp Whiteside test (Bhat F.A., Bhattacharyya H.K. (2014)) để kiểm tra mẫu dịch lấy từ tử cung bò.
Kết quả được trình bày tại bảng 4.1 và thể hiện trên hình 4.1
Bảng 4.1. Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh VTC tại một số xã thuộc huyện Ba Vì, HN
Địa điểm Số lượng bò theo dõi (con) Số bò bị viêm tử cung Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Vân Hòa 156 35 22,44 Yên Bài 125 38 30,40 Tản Lĩnh 105 22 20,95 Tổng số 386 95 24,61
Qua kết quả nghiên cứu tại hình 4.1 và bảng 4.1 cho thấy, trong 386 bò sữa nuôi tại của 03 xã thuộc huyện Ba Vì có 95 bò bị viêm tử cung sau đẻ, chiếm tỉ lệ 24,61%. Tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung tại các xã có sự chênh lệch khá lớn biến đổi từ 20,95% (Tản Lĩnh) đến 30,40% (Yên Bài).
Theo nghiên cứu của Dubuc J. and Duffield T. F. (2011) khi kiểm tra khảo sát 1295 bò sữa Holstein Friesian tại Canada, cho biết tỉ lệ mắc bệnh viêm tử cung là 17,6%. Sự sai khác ở các địa điểm theo dõi khác nhau (ở các xã khác nhau cho tỷ lệ viêm tử cung khác nhau khá phù hợp với nghiên cứu của Overton M. and J. Fetrow (2008)khi thấy rằngtỉ lệ mắc viêm tử cung ở bò sữa trung bình
vào khoảng 10%, nhưng ở một số trang trại tỉ lệ này có thể cao tới 20-30%. Theo chúng tôi sở dĩ có sự khác biệt nói trên ngoài sự khác biệt về giống bò và địa điểm nghiên cứu mà còn có tác động của vệ sinh thú y cho bò sữa sau đẻ.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng với một số nghiên cứu trước đây về tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung sau đẻ khi điều tra tại các địa phương thuộc đồng bằng sông Hồng như: Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa sau đẻ là khá cao tùy thuộc vào từng địa phương: 21,32% tại Hà Nội và Bắc Ninh (Nguyễn Văn Thanh và Lê Trần Tiến, 2007), 22,88% tại khu vực đồng bằng sông Hồng (Phạm Trung Kiên, 2012).
Hình 4.1. Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh VTC ở một số xã thuộc huyện Ba Vì, Hà Nội 4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH THÀNH PHẦN VI KHUẨN TRONG DỊCH TỬ CUNG CỦA BÒ SỮA
Nhằm tìm hiểu và xác định vi khuẩn gây ra bệnh viêm tử cung bò, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu dịch tử cung âm đạo của bò bình thường sau đẻ và dịch tử cung âm đạo của bò bị viêm để xét nghiệm và phân lập các vi khuẩn thường gặp trong tử cung bò và tình trạng bội nhiễm của nó khi tử cung bị viêm.
4.2.1. Kết quả xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa dịch tử cung của bò sữa
Kết quả xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa được thể hiện thông qua Bảng 4.2
Bảng 4.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò
Địa điểm
mẫu Loại mẫu
Số lượng mẫu
Tổng số (CFU/ml) (X ± SD)
Vân Hòa Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (6,23 ± 2,75) x10
6
Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (7,27 ± 3,31) x108
Yên Bài Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (6,75 ± 2,90) x10
6
Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (8,54 ± 2,86) x108
Tản Lĩnh Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (5,89 ± 2,71) x10
6
Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (7,16 ± 2,88) x108 Tổng số vi khuẩn hiếu khi trong dịch tử cung của bò không bị viêm (6,29 ± 2,90) x106 Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung của bò bị viêm (7,69 ± 3,31) x108
Qua bảng số liệu cho thấy, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung của bò bị viêm tử cung và không bị viêm tử cung là khác nhau rõ rệt (P<0,001).
Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch viêm tử cung tăng lên gấp 122,26