Định tính flavonoid

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.3. Nội dung nghiên cứu

3.3.1. Định tính flavonoid

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để

lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.

- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài

giọt dung dịch FeCl3 5%. Sẽ xuất hiện tủa xanh đen. 3.3.2. Định tính tanin

- Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung

dịch FeCl3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen.

- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung

dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng. 3.3.3. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung

- Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng.

- Tác dụng với thuốc thử Bouchardat (100ml nước, 2.5g I2, 5g KI): Lấy

một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu.

3.3.4. Định tính carotenoid

Thêm vào dịch chiết vài giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu có carotenoid, dung dịch có màu xanh dương.

3.3.5. Định tính polyphenol

Cho vào mỗi ống nghiệm 1 mẫu cao khô mỗi loại dịch chiết, thêm 2ml nước cất và hòa tan đều. Nhỏ vào mỗi ống 1ml FeCl3 2%, lắc đều. Dung dịch chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ có Polyphenol.

3.3.6. Định tính đường khử

Cho vào mỗi ống nghiệm một ít cao khô mỗi loại dịch chiết. Cho 2 ml nước cất vào mỗi ống, hòa tan, lắc đều. Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống, nếu có kết tủa đỏ gạch chứng tỏ có đường khử.

3.3.7. Định tính chất nhầy

Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ

xuất hiện tủa bông.

3.3.8. Định tính coumarin

Dựa vào độ tan khác nhau khi đóng và mở vòng lacton: cho vào ống

nghiệm mỗi ống 1 - 2 ml dịch chiết. Ống thứ nhất cho thêm 0.5 ml NaOH 10%, đun cách thủy cả 2 ống (ống có coumarin thường có màu vàng xuất hiện). Để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất. Nếu ống 1 đục hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà độ đục hoặc kết tủa như ống 2 thì sơ bộ xác định có coumarin.

3.4. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN VITRO CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN

* Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các đĩa thạch

Meuller-hinton có nồng độ nano bạc khác nhau. * Tiến hành:

Mật độ vi khuẩn đem cấy trộn là 108 tế bào/ml.

Nồng độ dung dịch nano đem cấy trộn là 100 ppm (nồng độ gốc).

Pha loãng nano theo dãy pha loãng như đã nêu ở trên (sử dụng nước đề ion để pha loãng nano), bổ sung vào mỗi ống 10 µl dịch khuẩn. Sau đó, ngâm các dịch khuẩn trong các nồng độ nano ở 2h, 4h, 8h.

* Tiến hành thử nghiệm: Sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch (Carvahol và cộng sự, 2011). Sau thời gian 2h, 4h, 8h lấy 100µl nano bạc được pha loãng ở các nồng độ khác nhau đã được bổ sung dịch khuẩn cấy chang trên đĩa thạch để quan sát khả năng ức chế vi khuẩn.

Nuôi tủ ấm 300/24 giờ, lấy ra đọc kết quả: Xác định nồng độ nano pha loãng thấp nhất còn có khả năng ức chế vi khuẩn.

3.5. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT THỰC VẬT KHI PHỐI TRỘN VỚI NANO BẠC CỦA DỊCH CHIẾT THỰC VẬT KHI PHỐI TRỘN VỚI NANO BẠC

Phối trộn dịch chiết với nano bạc: Hút 5ml dịch chiết thực vật được tách chiết, ở các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào các ống nghiệm, tiếp tục hút 5ml nano bạc ở nồng độ ức chế tối thiểu cho lần lượt vào các ống nghiệm này, lắc đều.

Hút 100µl hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc nhỏ lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được chang khuẩn. Sau đó nuôi ủ ở điều kiện 370C, sau 24h lấy ra đo đường kính vòng vô khuẩn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc dựa vào đường kính vòng vô khuẩn.

Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. TỶ LỆ MẮC BỆNH VIÊM TỬ CUNG TRÊN BÒ SỮA Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG THUỘC HUYỆN BA VÌ, THÀNH PHỐ HÀ NỘI

Theo số liệu thống kê đến tháng 10/2016, số lượng bò sữa của huyện Ba Vì đạt 8,1 nghìn con; chiếm 65% tổng đàn bò sữa toàn thành phố Hà Nội, sản lượng sữa đạt 26,5 nghìn tấn, tập trung chủ yếu tại xã Vân Hòa, Yên Bài, Tản Lĩnh. Hình thức chăn nuôi chủ yếu là nông trại hộ gia đình, bình quân từ 5-6 con/hộ.

Với mục đích đánh giá hiện trạng bệnh viêm tử cung sau đẻ của đàn bò sữa nuôi tại các xã có số lượng bò lớn thuộc huyện Ba Vì thành phố Hà Nội chúng tôi tiến hành điều tra bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp người chăn nuôi kết hợp với việc thăm khám trực tiếp và sử dụng phương pháp Whiteside test (Bhat F.A., Bhattacharyya H.K. (2014)) để kiểm tra mẫu dịch lấy từ tử cung bò.

Kết quả được trình bày tại bảng 4.1 và thể hiện trên hình 4.1

Bảng 4.1. Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh VTC tại một số xã thuộc huyện Ba Vì, HN

Địa điểm Số lượng bò theo dõi (con) Số bò bị viêm tử cung Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Vân Hòa 156 35 22,44 Yên Bài 125 38 30,40 Tản Lĩnh 105 22 20,95 Tổng số 386 95 24,61

Qua kết quả nghiên cứu tại hình 4.1 và bảng 4.1 cho thấy, trong 386 bò sữa nuôi tại của 03 xã thuộc huyện Ba Vì có 95 bò bị viêm tử cung sau đẻ, chiếm tỉ lệ 24,61%. Tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung tại các xã có sự chênh lệch khá lớn biến đổi từ 20,95% (Tản Lĩnh) đến 30,40% (Yên Bài).

Theo nghiên cứu của Dubuc J. and Duffield T. F. (2011) khi kiểm tra khảo sát 1295 bò sữa Holstein Friesian tại Canada, cho biết tỉ lệ mắc bệnh viêm tử cung là 17,6%. Sự sai khác ở các địa điểm theo dõi khác nhau (ở các xã khác nhau cho tỷ lệ viêm tử cung khác nhau khá phù hợp với nghiên cứu của Overton M. and J. Fetrow (2008)khi thấy rằngtỉ lệ mắc viêm tử cung ở bò sữa trung bình

vào khoảng 10%, nhưng ở một số trang trại tỉ lệ này có thể cao tới 20-30%. Theo chúng tôi sở dĩ có sự khác biệt nói trên ngoài sự khác biệt về giống bò và địa điểm nghiên cứu mà còn có tác động của vệ sinh thú y cho bò sữa sau đẻ.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng với một số nghiên cứu trước đây về tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung sau đẻ khi điều tra tại các địa phương thuộc đồng bằng sông Hồng như: Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa sau đẻ là khá cao tùy thuộc vào từng địa phương: 21,32% tại Hà Nội và Bắc Ninh (Nguyễn Văn Thanh và Lê Trần Tiến, 2007), 22,88% tại khu vực đồng bằng sông Hồng (Phạm Trung Kiên, 2012).

Hình 4.1. Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh VTC ở một số xã thuộc huyện Ba Vì, Hà Nội 4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH THÀNH PHẦN VI KHUẨN TRONG DỊCH TỬ CUNG CỦA BÒ SỮA

Nhằm tìm hiểu và xác định vi khuẩn gây ra bệnh viêm tử cung bò, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu dịch tử cung âm đạo của bò bình thường sau đẻ và dịch tử cung âm đạo của bò bị viêm để xét nghiệm và phân lập các vi khuẩn thường gặp trong tử cung bò và tình trạng bội nhiễm của nó khi tử cung bị viêm.

4.2.1. Kết quả xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa dịch tử cung của bò sữa

Kết quả xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa được thể hiện thông qua Bảng 4.2

Bảng 4.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò

Địa điểm

mẫu Loại mẫu

Số lượng mẫu

Tổng số (CFU/ml) (X ± SD)

Vân Hòa Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (6,23 ± 2,75) x10

6

Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (7,27 ± 3,31) x108

Yên Bài Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (6,75 ± 2,90) x10

6

Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (8,54 ± 2,86) x108

Tản Lĩnh Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (5,89 ± 2,71) x10

6

Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (7,16 ± 2,88) x108 Tổng số vi khuẩn hiếu khi trong dịch tử cung của bò không bị viêm (6,29 ± 2,90) x106 Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung của bò bị viêm (7,69 ± 3,31) x108

Qua bảng số liệu cho thấy, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung của bò bị viêm tử cung và không bị viêm tử cung là khác nhau rõ rệt (P<0,001).

Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch viêm tử cung tăng lên gấp 122,26 lần so với trong dịch tử cung của bò sữa không bị viêm (7,69±3,31)x108 CFU/ml so (6,29±2,90)x106 CFU/ml. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của (Nguyễn Văn Thanh và Trần Tiến Dũng, 2016) khi nghiên cứu về tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung bò. Kết quả nghiên cứu này cho thấy khi bò bị viêm tử cung thì tổng số vi khuẩn hiếu khi tăng lên rất mạnh (113,24 lần) so với đối chứng. Kết quả này phù hợp với nhận định của nhiều nghiên cứu trước đây đều cho thấy khi âm đạo và tử cung bị viêm thì số lượng vi khuẩn trong dịch viêm tăng lên gấp nhiều lần so với trong dịch tử cung sau đẻ ở bò không bị viêm, thể hiện quá trình nhiễm trùng bội nhiễm (Nguyễn Văn Thanh và Lê Trần Tiến, 2007).

Kết quả nghiên cứu cho thấy của chúng tôi cho thấy, trong dịch của bò không viêm cũng tồn tại vi khuẩn hiếu khí. Kết quả này phù hợp với nhiều nhận định của các tác giả khác khi nghiên cứu. Theo các nghiên cứu nhận thấy 95% vi khuẩn có thể có mặt trong môi trường tử cung của bò sau khi đẻ (I. M. Sheldon and H. Dobson., (2004), nhưng điều đó không đồng nghĩa với việc tử cung bị viêm vì thực tế tỉ lệ bò bị viêm tử cung sau đẻ được công bố là nhỏ hơn rất nhiều so với tỉ lệ bò có chứa vi khuẩn trong tử cung sau khi đẻ (Overton M. and J. Fetrow, 2008; Dubuc J.and Duffield T. F., 2011).

Nghiên cứu của K. W. Pulfer and R. L. Riese (1991) cho thấy việc các vi khuẩn xuất hiện trong tử cung của bò sau khi đẻ không nhất thiết phải được coi là bất bình thường. Số lượng của vi khuẩn sẽ giảm nhanh sau khi đẻ, và thông thường thì sau 3-4 tuần sau đẻ, vi khuẩn sẽ được loại bỏ hết khỏi môi trường tử cung của bò, hoặc chỉ xuất hiện với một số lượng rất thấp. Chỉ khi nào việc loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tử cung bị trở ngại, số lượng của chúng tăng lên nhiều lần thì viêm tử cung mới xảy ra. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi mà số lượng vi khuẩn trong dịch tử bị viêm tăng lên gấp nhiều lần số lượng vi khuẩn có trong dịch tử cung của bò không bị viêm.

4.2.2. Kết quả xác định sự biến đổi về thành phần vi khuẩn hiếu khí có trong dịch viêm tử cung của bò sữa dịch viêm tử cung của bò sữa

Với mục đích tìm hiểu sâu hơn nữa về thành phần các vi khuẩn có trong dịch tử cung bò bị viêm cũng như bò không bị viêm để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo, các mẫu bệnh phẩm được tiến hành phân lập và phân tích để tìm ra sự có mặt của các loại vi khuẩn trong dịch tử cung, từ đó thấy được sự biến đổi về thành phần của các vi khuẩn trong tử cung của bò bị viêm và không bị viêm tử cung. Kết quả của phân tích được thể hiện ở bảng 4.3.

Bảng 4.3. Tần suất xuất hiện của một số VKHK trong dịch tử cung

Vi khuẩn Dịch tử cung của bò không bị VTC Dịch tử cung của bò bị VTC

E. coli 0 %(0/10) 0 %(0/10)

Salmonella 0 %(0/10) 0 %(0/10)

Staphylococcus spp 20,00 %(2/10) 100 %(9/9)

Kết quả cho thấy, tất cả các mẫu dịch tử cung ở bò không bị viêm tử cung và bò bị viêm viêm tử cung đều không có E. coli và Salmonella. Đối với dịch tử cung của bò không bị viêm, tỷ lệ mẫu phát hiện thấy Staphylococcus và

Streptococcus đều là 20,00%. Đối với dịch của bò viêm tử cung, Staphylococcus

và Streptococcus được phát hiện ở 100% mẫu bệnh phẩm.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi lại khá phù hợp với các nghiên cứu tại Việt Nam trước đây khi tỷ lệ phân lập được vi khuẩn Staphylococcus và

Streptococcus từ dịch viêm tử cung bò đều là 100%. Nghiên cứu trên bò sữa tại

Tiên Du, Bắc Ninh (Lê Trần Tiến, 2006), bò vàng tại Lập Thạch, Vĩnh Phú (Nguyễn Trọng Thiện, 2009) và bò vàng ở Sông Lô, Vĩnh Phú (Dương Quốc Tuấn, 2013) đều cho kết quả tỷ lệ vi khuẩn Staphylococcus và Streptococcus xuất hiện trong dịch viêm tử cung là 100%. Một số kết quả nghiên cứu khác cho thấy ngoài hai loại vi khuẩn trên thì E. coli, Salmonella cũng có thể xuất hiện ở trong dịch tử cung âm đạo của bò sữa nhưng với tỷ lệ thấp (Nguyễn Văn Thanh và Lê Trần Tiến, 2007). Có sự sai khác này theo chúng tôi là do trong nghiên cứu của nhóm tác giả trên, mẫu bệnh phẩm được lấy từ các bò sữa loại thải, được giết mổ ở các lò mổ. Những bò sữa này thường là những con mắc bệnh, không chửa đẻ, viêm đường sinh dục nặng nên việc có các loài vi khuẩn khác như E. coli,

Salmonella trong đường sinh dục là có cơ sở.

Khi so sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với một số nghiên cứu trên thế giới lại thấy xuất hiện sự sai khác. Kết quả phân lập vi khuẩn của chúng tôi không phát hiện thấy E.coli trong dịch viêm tử cung bò, trong khi đó theo nghiên cứu của Dolezel R. and Palenik T. (2010) cho thấy ở trong dịch tử cung sau đẻ của bò không có triệu chứng viêm tử cung thì Bacillus spp là vi khuẩn xuất hiện nhiều nhất (46%) kế đến là E. coli (23%) và không có Staphylococcus và

Arcanobacterium pyogenes. Tuy nhiên ở bò có triệu chứng viêm nhẹ thì

Arcanobacterium pyogenes xuất hiện ở 44% không tìm thấy E. coli và

Staphylococcus xuất hiện ở 13% mẫu bệnh phẩm.

Theo kết quả phân lập của chúng tôi không thấy xuất hiện sự có mặt của

Arcanobacterium pyogenes trong dịch viêm tử cung bò tuy nhiên theo tác giả

Dolezel R. and Palenik T. (2010) lại kết luận vi khuẩn Arcanobacterium

pyogenes là yếu tố quan trọng gây ra bệnh viêm tử cung ở bò. Trong nghiên cứu

này nhóm tác giả Dolezel R. and Palenik T. (2010) đã nhận thấy khi bò bị viêm tử cung nặng thì có tới 75% mẫu bệnh phẩm xuất hiện Arcanobacterium

pyogenes các vi khuẩn Bacillus spp, E. coli, Staphylococcus xuất hiện với tỉ lệ lần lượt là 25,00%; 25,00% và 13,00%.

4.3. ĐÁNH GIÁ HIỆU SUẤT VÀ ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG CAO KHÔ DỊCH CHIẾT BỒ CÔNG ANH SỬ DỤNG CÁC TRONG CAO KHÔ DỊCH CHIẾT BỒ CÔNG ANH SỬ DỤNG CÁC DUNG MÔI TÁCH CHIẾT KHÁC NHAU

4.3.1. Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau môi tách chiết khác nhau

Hình 4.2. Dược liệu Bồ Công Anh và bột

Chiết xuất là phương pháp dung các dung môi khác nhau để lấy chất tan ra khỏi mô thực vật. Dịch chiết là sản phẩm ta thu được trong quá trình này là dung dịch chứa các chất hòa tan trong dung môi đó. Các yếu tố như bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào hay kích thước tiểu phân bột dược liệu… ảnh hưởng trực tiếp lên qua trình tách chiết và chúng cũng sẽ quyết định chất lượng của dịch chiết ta thu được.

Chúng tôi tiến hành thu dịch chiết Bồ Công Anh trong các loại dung môi: Ethanol 70%, methanol 80%, ethyl acetate, n-hexane và n-butanol.