SÂM(Coprinus comatus) TRONG GIAI ĐOẠN NHÂN GIỐNG DỊCH THỂ.
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccarozo đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 200ml
Nhằm xác định đƣợc hàm lƣợng saccarozo thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng và phát triển của giống nấm Địa sâm dịch thể cấp 2 chúng tôi tiến hành bố trí 5 thí nghiệm với các tỷ lệ khác nhau, lƣợng giống cấy vào mỗi chai là 20ml giống cấy cấp 1. Sau khi cấy giống đƣa các chai giống lên máy lắc 150 vòng/ phút, nhiệt độ phòng khoảng 250C, thời gian nuôi là 4 ngày. Tiến hành đo kích thƣớc, mật độ, sinh khối sợi và đặc điểm hình thái sợi. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccarozo đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Địa sâm
Công thức Kích thƣớc
KLC(mm)
Mật độ KLC
Sinh khối
sợi (g/l) Đặc điểm hình thái hệ sợi
CT1(10g) 0,4 ++ 19,1 Sợi phân tán, chƣa có tua, dịch huyền phù
CT2(15g) 0,6 +++ 28,3 KLC nhỏ, ít tua, dịch huyền phù
CT3(20g) 1,3 ++++ 35,5 Sợi liên kết chặt, KLC to đều, có tua, mật độ nhiều CT4(25g) 1,0 ++++ 32,7 Dịch giống hơi nhớt, KLC
to, có tua dài
CT5(30g) 0,7 +++ 27,2 Dịch giống đặc, nhớt, KLC ít tua LSD0.05 0,3 1,7 CV% 2,2 3,2 Ghi chú: +: Số lƣợng KLC từ 10 – 30 KLC/10ml ++: Số lƣợng KLC từ 31 – 60 KLC/10ml +++: Số lƣợng KLC từ 61 – 90 KLC/10ml ++++: Số lƣợng KLC từ 91 – 120 KLC/10ml
Qua số liệu ở bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy ở công thức 1 kích thƣớc khuẩn lạc cầu nhỏ nhất chỉ đạt 0,4 mm, mật độ khuẩn lạc ít nhất, hệ sợi phân tán khuẩn lạc cầu chƣa có tua, dịch giống dạng huyền phù, sinh khối sợi thấp nhất đạt 19,1g/l. Khi tăng dần hàm lƣợng saccarozo lên 15g/l, 20g/l thì kích thƣớc, mật độ khuẩn lạc và sinh khối sợi cũng tăng dần lên và đạt cao nhất ở CT3 với đƣờng kính KLC là 1,3mm, mật độ KLC dày đặc và sinh khối sợi đạt 35,5g/l.
CT1 CT2 CT3
CT4 CT5
Hình 4.1. Ảnh hƣởng của tỉ lệ saccarozo đến hệ sợi nấm Địa sâm
Khi tiếp tục tăng lƣợng saccarozo lên 25g/l và 30g/l tác giả thấy tất cả các chỉ số thí nghiệm đều có xu hƣớng giảm dần. Kích thƣớc khuẩn lạc và sinh khối sợi nấm ở CT4 tƣơng ứng là 1,0 mm và 32,7g/l, dịch giống có hiện tƣợng bị nhớt, khuẩn lạc cầu to nhƣng kích thƣớc các khuẩn lạc không đều, tua sợi dài.
Ở CT5 khi hàm lƣợng saccarozo là 30g/l thì kích thƣớc KLC và mật độ khuẩn lạc giảm rõ rệt, đặc biệt là sinh khối sợi giảm chỉ đạt 27,2 g/l, dịch giống rất nhớt, KLC ít tua, kích thƣớc không đồng đều và mật độ KLC thƣa. Sự sụt giảm nhiều của SK sợi giữa CT5 so với CT3 và CT4 thể hiện sự mất cân bằng về tỉ lệ C/N trong môi trƣờng dịch giống.
Dựa vào các chỉ tiêu nghiên cứu, đặc biệt là sinh khối sợi chúng tôi nhận thấy CT3 (20g saccarozo) là công thức tối ƣu nhất và dùng CT3 phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của lƣợng giống cấy cấp 2 đến sinh trƣởng của hệ sợi nấm Địa sâm giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml sợi nấm Địa sâm giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml
Tỉ lệ giống cấy vào môi trƣờng dịch thể là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng của giống, tới mật độ kích thƣớc của KLC nấm Địa sâm. Trong nghiên cứu theo dõi ảnh hƣởng của tỷ lệ giống cấy đến sinh trƣởng và phát triển của giống nấm Địa sâm chúng tôi sử dụng nguồn giống cấp 2 dịch thể 200ml. Công thức môi trƣờng dịch thể tối ƣu nhất ở thí nghiệm 1 đƣợc sử dụng làm môi trƣờng nhân giống trung gian dạng dịch thể 2000ml. Bố trí các tỉ lệ giống cấy là 3%, 5%, 7%, 10% và 15% lƣợng giống so với môi trƣờng. Các công thức sau khi đƣợc cấy giống sẽ đƣợc đƣa sang phòng ƣơm nhiệt độ 250
C nuôi trong 4 ngày với lƣu lƣợng sục khí 0,7V/V/M.
Chúng tôi tiến hành theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển hệ sợi nấm trong suốt quá trình nuôi, kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của lƣợng giống cấy đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Địa sâm 2000ml
Công thức Kích thƣớc KLC
(mm) Mật độ KLC Sinh khối sợi (g/l)
CT1 (3%) 1,6 ++ 25,9 CT2 (5%) 1,3 ++ 27,8 CT3 (7%) 1,2 +++ 31,4 CT4 (10%) 1,1 ++++ 35,6 CT5 (15%) 1,0 ++++ 34,5 LSD0,05 0,6 1,2 CV% 2,6 2,1 Ghi chú: +: Số lƣợng KLC từ 10 – 30 KLC/10ml ++: Số lƣợng KLC từ 31 – 60 KLC/10ml +++: Số lƣợng KLC từ 61 – 90 KLC/10ml ++++: Số lƣợng KLC từ 91 – 120 KLC/10ml
Dựa vào bảng số liệu chúng tôi thấy tỉ lệ giống cấy ảnh hƣởng nhiều đến mật độ khuẩn lạc cầu (KLC) và sinh khối (SK) sợi nấm Địa sâm. Cấy giống mẹ với tỉ lệ nhỏ 3% giống so với môi trƣờng (60ml) thu đƣợc giống nấm có mật độ KLC thấp, kích thƣớc KLC to (1,6mm) và SK sợi nhỏ (26,8g/l). Khi tăng tỉ lệ giống cấy lên 7% giống so với môi trƣờng nuôi (140ml)thì kích thƣớc KLC có xu hƣớng giảm xuống 1,3mm tuy nhiên mật độ KLC và SK sợi lại có xu hƣớng tăng lên đạt 27,8 g/l.
Khi sử dụng giống mẹ với tỉ lệ 10% giống so với môi trƣờng nuôi thì thu đƣợc giống nấm có mật độ KLC cao, kích thƣớc KLC (1,1mm) đặc biệt SK sợi cao nhất so với các mức cấy giống khác (35,6g/l).
Tiếp tục tăng mức giống mẹ lên 15% giống so với môi trƣờng nuôi thì kích thƣớc KLC giảm chỉ còn 1,0mm, các KLC có hiện tƣợng vị vón lại nhau và SK sợi có sự thụt giảm nhẹ (34,5g/l).
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thùy (2014) trên nấm Sò vua và Vân chi cũng cho thấy khi mật độ cấy tăng lên thì SK sợi giảm, với lƣợng giống cấy 7% và 10% ống gốc thì SK sợi của nấm Sò vua và Vân chi là 33,7g/l và 35,6g/l. Tuy nhiên lƣợng giống cấy tăng lên 15% ống gốc thì dịch nuôi cấy dạng huyền phù, khí lƣu thông khó khăn, các KLC có kích thƣớc nhỏ, thƣờng kết vón với nhau, SK sợi của cả hai giống không tăng mà có xu hƣớng giảm.
Sự lƣu thông dòng chảy trong môi trƣờng dịch thể bị ảnh hƣởng mạnh bởi SK sợi nấm (Hwang et al., 2004) khi cấy mật độ quá lớn dẫn đến sự gia tăng lớn về độ nhớt của môi trƣờng, gây ra khó khăn cho việc hấp thụ dinh dƣỡng và trao đổi oxy. Các nghiên cứu trƣớc đều phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả, nhƣ vậy khi cấy lƣợng giống quá lớn tới 15% giống so với môi trƣờng thì kích thƣớc KLC có xu hƣớng giảm, dịch thƣờng có dạng huyền phù cao, khó khăn cho sự lƣu thông của sợi nấm trong môi trƣờng dịch thể.
Nhƣ vậy công thức tốt nhất ở thí nghiệm 2 là công thức 4 (10% giống so với môi trƣờng nhân nuôi) là thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng, phát triển và sinh khối sợi nấm Địa sâm và đƣợc sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của lƣu lƣợng sục khí đến sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml
Môi trƣờng trung gian chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm này là môi trƣờng dịch thể tƣơng tự nhƣ môi trƣờng tối ƣu trong nhân giống cấp 2 (200ml). Lƣợng oxy cung cấp trong quá trình nuôi cấy nấm dịch lỏng là điều kiện không thể thiếu trong quá trình lên men. Trong quá trình lên men, các vi sinh vật và sợi nấm không ngừng tiêu thụ oxy, làm cho nồng độ oxy hòa tan luôn có xu hƣớng giảm xuống, chế độ cấp khí thích hợp sẽ cung cấp đầy đủ oxy, nâng cao mức độ tiếp xúc của sợi nấm với oxy vì vậy sợi nấm sinh trƣởng khỏe hơn, tạo nhiều sinh khối hơn.
Theo Nguyễn Thị Bích Thùy (2014), tốc độ sục khí ảnh hƣởng nhiều đến sự sinh trƣởng của sợi nấm. Thông thƣờng thì trong giới hạn cho phép, chế độ cấp khí càng cao thì mật độ KLC càng nhiều, SK sợi càng tăng. Tuy nhiên nếu chế độ sục khí quá mạnh thì SK sợi lại giảm, do tốc độ cao tạo lực cắt lớn làm sợi nấm bị tổn thƣơng, giảm sự tăng trƣởng của sợi nấm.
Giống nấm đƣợc lên men chìm trong môi trƣờng nhân giống, có bổ sung oxy bằng máy bơm sục khí có màng lọc midisard 0,02µm. Lƣu lƣợng cấp khí bơm vào trong môi trƣờng ở các mức khác nhau, mật độ KLC ở các mức sục khí: 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 và 0,8 lít không khí/ phút (V/V/M) đƣợc ghi nhận ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của lƣu lƣợng sục khí đến sinh trƣởng sợi nấm Địa sâm
Lƣu lƣợng sục khí (V/V/M)
Kích thƣớc KLC
(mm) Mật độ KLC
Sinh khối sợi (g/l) CT1(0,4) 1,5 + 21,1 CT2(0,5) 1,3 ++ 28,3 CT3(0,6) 1,3 ++++ 32,5 CT4(0,7) 1,1 ++++ 35,7 CT5(0,8) 0,9 ++++ 33,6 LSD0.05 0,4 0,8 CV% 1,6 1,5 Ghi chú: +: Số lƣợng KLC từ 10 – 30 KLC/10ml ++: Số lƣợng KLC từ 31 – 60 KLC/10ml +++: Số lƣợng KLC từ 61 – 90 KLC/10ml ++++: Số lƣợng KLC từ 91 – 120 KLC/10ml
Qua bảng số liệu chúng tôi nhận thấy khi mức cấp khí là 0,4 V/V/M (CT1) thì kích thƣớc các KLC lớn nhất (1,5mm) nhƣng mật độ KC và sinh khối sợi nấm thấp nhất chỉ đạt 21,1 g/l. Các KLC to có tua dài và dịch nuôi trong.
Khi tăng dần mức cấp khí lên 0,5 và 0,6 V/V/M thì kích thƣớc KLC có xu hƣớng giảm tuy nhiên mật độ KLC và sinh khối sợi nấm lại tăng lên rõ rệt đạt 28,3
g/l và 32,5 g/l. Các sợi nấm liên kết chặt hơn KLC tròn có tua sợi và kích thƣớc đồng đều.
Khi tăng lƣu lƣợng cấp khi lên 0,7 V/V/M tác giả nhận thấy kích thƣớc KLC tiếp tục giảm, KLC tƣơng đối đồng đều, một số KLC bị phân tách tạo thành các dải sợi nấm có kích thƣớc nhỏ và không đồng nhất. Sinh khối sợi nấm tiếp tục tăng đạt 35,7 g/l.
Tiếp tục tăng lƣu lƣợng cấp khí lên 0,8 V/V/M thì kích thƣớc KLC có sự khác biệt rõ rệt với các công thức trên và đạt nhỏ nhất là 0,9 mm, mật độ KLC dày tuy nhiên kích thƣớc lại không đồng đều, rất nhiều KLC bị phân tách tạo thành các dải sợi nấm nhỏ hơn và không đồng nhất, dịch nuôi cấy hơi nhớt.
Nhƣ vậy khi tăng dần lƣu lƣợng cấp khí thì kích thƣớc KLC có xu hƣớng giảm, các KLC từ những viên có kích thƣớc to tròn sẽ bị phân cắt tạo thành các KLC hoặc dải sợi nấm nhỏ hơn do sự cấp khí tăng lên.
Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy sự khác biệt giữa hình dạng KLC khi nuôi trên bình lắc và bình sục khí, KLC nuôi trong bình sục khí có tua sợi dài hơn so với trong bình lắc.
Theo Bum và cs (2008) thì cƣờng độ sục khí có ảnh hƣởng rõ rệt đến hình thái KLC, nuôi trong điều kiện sục khí là 0,5 V/V/M thì KLC có hình viên tròn hơi có lông tua. Nuôi trong điều kiện sục khí là 1,16 V/V/M thì KLC có tua dài.
Dựa vào các số liệu thu thập đƣợc chúng tôi nhận thấy CT4 (0,7V/V/M) thu đƣợc sinh khối sợi cao nhất và hình thái khuẩn lạc đẹp nhất và đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian nuôi giống đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml
Chu kỳ sinh trƣởng của giống nấm trải qua 4 giai đoạn: giai đoạn thích nghi với môi trƣờng mới, giai đoạn tăng trƣởng (pha tăng tốc: mật độ tế bào bắt đầu tăng, pha tăng trƣởng cực đại, pha tăng chậm), giai đoạn ổn định và giai đoạn suy tàn. Giống dịch thể có tốc độ tăng trƣởng rất nhanh, do đó việc xác định thời gian sợi nấm đạt đến giai đoạn hoạt lực khỏe nhất, sinh khối cao nhất rất quan trọng, (Nguyễn Thị Bích Thùy, 2014).
Hình 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi giống đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Địa sâm
Trong thí nghiệm nhân giống nấm Địa sâm chúng tôi sử dụng môi trƣờng dịch tối ƣu ở thí nghiệm 1 là CT3 (20g saccarozo + 5g CNM + 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4), pH môi trƣờng 7, giống nấm nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25±1oC, tốc độ sục khí 0,7 V/V/M. Định kỳ lấy giống nấm các giai đoạn tuổi giống khác nhau (sau nuôi 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày và 6 ngày) để quan sát. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi giống đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Địa sâm 2000ml Công thức Kích thƣớc KLC (mm) Mật độ KLC Sinh khối sợi (g/l) Đặc điểm hệ sợi sau nuôi 2 ngày 0,6 ++ 18,4
Sợi phân tán, chƣa bám thành bình, dịch trong
sau nuôi
3 ngày 0,7 +++ 27,7
Sợi liên kết chặt,KlC ít tua, mật độ dày, dịch trong
sau nuôi 4
ngày 1,0 ++++ 36,3
Sợi liên kết chặt, KLC to, nhiều tua
sau nuôi 5
ngày 1,3 ++++ 36,1
Sợi liên kết chặt, KLC to, dịch đặc
sau nuôi 6
ngày 1,3 ++++ 36,0
Dịch đặc sệt, KLC to, phần lớn biến dạng tan thành sợi nhỏ hơn
LSD0,05 0,5 0,7
CV% 2,7 1,3
CT1 CT2 CT3
Ghi chú: +: Số lƣợng KLC từ 10 – 30 KLC/10ml
++: Số lƣợng KLC từ 31 – 60 KLC/10ml
+++: Số lƣợng KLC từ 61 – 90 KLC/10ml
++++: Số lƣợng KLC từ 91 – 120 KLC/10ml
Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau khi cấy và nuôi giống trong 2 ngày đầu hệ sợi nấm Địa sâm sinh trƣởng chậm, sợi phân tán và chƣa bám vào thành bình, dịch trong. Kích thƣớc KLC rất nhỏ và chƣa liên kết chặt. Sinh khối sợi thấp nhất 18,4 g/l.
Trong khoảng thời gian sau nuôi đến 3 ngày chúng ta có thể quan sát bằng mắt thƣờng thấy mật độ và kích thƣớc KLC của nấm Địa sâm bắt đầu tăng mạnh. Sinh khối sợi nấm đạt 27,7 g/l gấp 1,5 lần sinh khối sợi tại ngƣỡng sau nuôi 48h. Các sợi nấm liên kết chặt tạo thành các KLC có kích thƣớc đồng đều với đƣờng kính khuẩn lạc trung bình đạt 1,0 mm, mật độ KLC dày có tua ngắn và dịch giống trong.
Theo dõi hình thái KLC sau nuôi 4 ngày tác giả thấy kích thƣớc KLC trung bình đạt 1,0 mm, các sợi nấm liên kết chặt nhiều tua và mật độ dày đặc. Định kỳ sau mỗi khoảng thời gian, lấy dịch để ly tâm và sấy khô thu sinh khối, kết quả ghi nhận ở bảng 4.4 cho thấy SK sợi có sự sinh trƣởng rõ trong thời gian 48-96h và đạt cực đại tại ngƣỡng 96h sau nuôi (SK sợi đạt 36,3g/l).
Tiếp tục theo dõi đặc điểm hệ sợi nấm và sinh khối sợi tại ngƣỡng 5 ngày sau nuôi tác giả nhận thấy dịch có sự gia tăng độ huyền phù (dịch đặc), lúc này sự vận chuyển của dịch rất khó khăn, KLC to có tua sợi.
Tại ngƣỡng 6 ngày sau nuôi tất cả các chỉ tiêu theo dõi đều có xu hƣớng không tăng thêm về kích thƣớc, mật độ cũng nhƣ sinh khối sợi. Dịch giống tại thời điểm này đặc sệt, sự vận chuyển của dòng chảy rất khó khăn, các KLC có rất dài và bắt đầu biến dạng tan thành sợi nấm có kích thƣớc nhỏ hơn, sinh khối sợi giảm nhẹ.
Qua các chỉ tiêu theo dõi về đặc điểm hình thái, đặc biệt là sinh khối sợi chúng tôi nhận thấy CT3 (sau nuôi 4 ngày) cho sinh khối sợi cao nhất và đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
4.2. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI GIÁ THỂ, ĐỘ ẨM GIÁ THỂ, NHIỆT ĐỘ KHÔNG KHÍ, ẨM ĐỘ KHÔNG KHÍ, LOẠI ĐẤT PHỦ ĐẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN NẤM ĐỊA SÂM TRONG GIAI ĐOẠN NUÔI TRỒNG
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần cơ chất phối trộn đến sinh trƣởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng